식중독(food poisoning)은 식품을 매개로 하여 나타나는 질환으로 인체 유해 미생물 혹은 화학물질 등에 오염된 신선식품 혹은 육가공품을 섭취함으로서 나타난다. 미생물에 의한 식중독은 크게 Staphylococcus aureus와 Bacillus cereus 등의 박테리아를 대표로 하는 장독소 기전을 통한 비염증성 설사를 동반하는 경우와 Salmonella 속 박테리아를 대표로 하는 장관 침습 혹은 세포독소 기전을 통한 염증성 설사를 동반하는 경우로 나눌 수 있다. 이런 미생물에 의한 식품오염을 막기 위해 신선식품 혹은 육가공품의 생산, 가공, 유통 등 소비자에 도달하기 하기 전 과정에 오염요인 관리하고 좀 더 정교한 미생물 탐색 기술을 개발하고자 노력하고 있다(Lim and Kim, 2017; Choi et al., 2019). 동시에 식품을 장기간 안전하게 보존하고자 항균효과를 가지는 식품 보존제를 사용하는데 천연자원의 항균 활성과 항균물질을 탐색하고 산업적으로 응용하는 방법에 대한 연구 또한 꾸준히 진행되어 오고 있다(Yang and Lee, 2013; Lee et al., 2015; Lee et al., 2017; Liu et al., 2017; Yu et al., 2019).

Oenothera 속의 달맞이꽃은 남 · 북 아메리카가 원산지로 우리나라에서는 전국적으로 자생하나 특히 남부해안과 제주도에서 주로 찾아볼 수 있다고 알려져 있다. Oenothera 속 달맞이꽃의 생리활성 효능과 관련하여 항산화, 항염증, 항암 등이 보고된 바 있어 산업적으로 이용가치가 높다고 평가되고 있으며 특히 달맞이꽃의 씨의 생리활성 연구는 매우 활발한 편이다(Yoon et al., 2009; Almora-Pinedo et al., 2017; Timoszuk et al., 2018; Pajak et al., 2019). Oenothera 속 달맞이꽃의 항균 작용과 관련하여 애기달맞이꽃(Oenothera laciniata) 전초 80% 에탄올 추출물과 분획물이 항균효과를 보였으며(Kim et al., 2007) 달맞이꽃(Oenothera biennis) 70% 에탄올 추출물의 경우 S. aureus, E. coli, S. Typhi에 대해서는 성장억제 효과를 보이지 않았으나 Bacillus cereus에 대해서는 성장억제를 보였다(Kim and Lee, 2016). 긴잎달맞이꽃(Oenothera odorata) 뿌리 75% 메탄올 추출물과 분획물 대상으로 항균효과 실험했을 때는 클로로포름 분획물이 Streptococcus 속에 대해 상대적으로 높은 항균력 보였다(Shin et al., 1994). 하지만 Oenothera 속 달맞이꽃 중 큰달맞이꽃(Oenothera lamarckiana)이 식품부패 및 식중독 관련 균에 대한 성장억제 효과가 보고된 바 없다. 본 연구는 큰달맞이꽃 지상부 추출물을 대상으로 항균효과가 있는지 실험하여 식품과 관련하여 효용이 있는지 기초적인 자료를 제시하고자 한다.

큰달맞이꽃(Oenothera lamarckiana)의 지상부 추출물은 한국식물추출물은행에서 구매하여 사용하였다. 추출물은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹인 후 분주하여 -20도에서 보관하였다. 실험에 사용한 bacteria에 대한 정보는 Table 1과 같다. 실험 균주는 보통한천배지(Becton-Dickinson, New Jergy, USA)에 계대 배양하여 사용하였다. 30℃ 혹은 37℃에서 18시간 배양한 세균의 집락을 취하여 멸균 생리식염수로 옮겨 각각의 균수를 McFarland 탁도 0.5 (1.5 × 10⁸/mL)에 맞추어 세균 부유액을 준비하였다. Muller-Hinton 평판배지(Becton-Dickinson) 표면에 멸균된 면봉을 이용하여 세균 부유액을 3회 반복하여 도말하였다. DMSO에 녹인 20 mg/mL과 동일 용매로 희석한 2 mg/mL 10 μL를 paper disc (6 mm)에 처리한 후 건조하여 용매를 제거하였다. 대조군으로 DMSO 10 μL를 paper disc에 처리하여 건조한 것을 사용하였다. Paper disc를 박테리아를 도말한 평판배지 위에 올려놓고 밀착시켰다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 disc 주변에 생성된 생육억제환(clear zone)의 지름을 측정하였다. 배양된 세균의 집락을 취하여 각각의 균수를 최종 1 × 10⁵/mL가 되도록 Muller-Hinton 액체배지(Becton-Dickinson, MA, USA)에 세균 부유액을 준비하였다. 큰달맞이꽃 추출물은 최소 농도 0.13 mg/mL에서 최대 농도 2 mg/mL의 범위 내에서 Muller-Hinton 액체배지에 단계 희석하였다. 대조군과 각 실험군에 동일한 최종 용매의 양(%)이 되도록 DMSO를 첨가하였다. 농도별 추출물과 세균 부유액을 96 well plate에 각각 100 μL씩 분주한 후 18시간 배양하였다. 최소억제농도(MIC)는 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균 증식의 억제가 일어나는 최소 농도로 결정하였다. 큰달맞이꽃 추출물을 0.06, 0.13, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/mL 농도가 되도록 Mueller Hinton 액체배지에 희석한 후 2 × 10⁵/mL로 희석된 세균을 각각 100 μL씩 96 well plate에 접종하였다. 37℃의 배양기에서 배양하면서 배양 직후부터 18시간 후까지 매 2시간마다 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 순수한 액체배지에 세균을 접종한 후 실험군과 동일한 방법으로 배양하면서 측정하였다. 측정값은 독립적으로 이루어진 3회의 실험에서 얻은 값을 mean ± SD로 나타내었다. 시료들 간의 통계분석은 GraphPad Prism 6을 이용하여 일원분산분석과 turkey's multiple comparisons로 이뤄졌다(P < 0.05).

Table 1

List of bacteria used for anti-bacterial effect of O. lamarckiana

Gram staining	Strain		Media	Temp.
Positive	Staphylococcus aureus	ATCC 25923	Nutrient agar	37℃
	MRSA1)	ATCC 43300	Nutrient agar	37℃
	Bacillus cereus	ATCC 13061	Nutrient agar	30℃
Negative	Shigella dysenteriae	ATCC 13313	Nutrient agar	37℃
	Escherichia coli	ATCC 25922	Nutrient agar	37℃
	Escherichia coli O157:H7	ATCC 35150	Nutrient agar	37℃
	Salmonella Typhi	ATCC 19430	Nutrient agar	37℃
	Salmonella enteritidis	ATCC 13076	Nutrient agar	37℃

¹⁾ Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Paper disc assay에서 O. biennis 전초 건조물의 70% 에탄올 추출물이 B. cereus에 대해서는 항균효과를 보였으나 S. aureus, E. coli 및 S. Typhimurium에 대해서는 항균효과를 이지 않은 것으로 보고된 바 있으며(Kim and Lee, 2016) O. laciniata 전초의 80% 에탄올 추출물 및 분획물의 경우 에틸아세테이트 분획물이 B. cereus, L. monocytogenes, S. aureus, E. coli, S. enteritidis, S. Typhimurium에 대해 가장 강력한 항균력을 보였다(Kim et al., 2007). 본 연구에서 O. lamarckiana 지상부의 메탄올 추출물은 20 μg/disc에서 실험 대상이 된 박테리아에 대해 clear zone을 보이지 않았지만 200 μg/disc에서 S. aureus, MRSA, B. cereus와 S. dysenteriae에 대해 각각 12, 12, 8, 15 mm의 clear zone을 보였다(Table 2, Fig. 1). Oenothera 속 달맞이꽃의 종, 부위, 추출 용매 등의 조건에 따라 항균의 양상이 다르게 나타날 수 있음을 보여준다. 좀 더 종합적으로 종별, 부위별, 추출방법별로 비교하여 실험이 이뤄져야 할 것으로 생각한다.

Table 2

Clear zone (mm) of treatment with O. lamarckiana against bacteria

Gram staining	Strain	Concentration (μg/disc)
		20	200
Positive	Staphylococcus aureus	-1)	12
	MRSA2)	-	12
	Bacillus cereus	-	8
Negative	Shigella dysenteriae	-	15
	Escherichia coli	-	-
	Escherichia coli O157:H7	-	-
	Salmonella Typhi	-	-
	Salmonella enteritidis	-	-

¹⁾ No clear zone

²⁾ Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Fig. 1. Anti-bacterial effect of O. lamarckiana against S. aureus (A), MRSA (B) and B. cereus (C) and S. dysenteriae (D), E. coli (E), E. coli 0157 (F), S. Typhi (G), S. enteritidis (H). Vehicle: Disc which was added with DMSO, 200: 200 μg/disc, 20: 20 μg/disc.

O. lamarckiana 지상부의 메탄올 추출물은 S. aureus와 MRSA에 대해 125 μg/mL에서는 성장억제가 뚜렸하지 않았으나 250 μg/mL에서는 대조군 대비하여 50% 이상 성장을 억제하여 MIC는 250 μg/mL로 생각되며 S. auresu와 MRSA간의 큰 차이는 보이지 않았다(Fig. 2 and 3). B. cereus와 S. dysenteriae에 대해서는 농도의존적으로 성장을 억제하는 양상을 보였다(Fig. 2 and 3). S. aureus에 대해 생약재 추출물 중 우슬의 MIC는 156.25 μg/mL, 목단피와 항백은 625 μg/mL (Cai et al., 2002). 지유는 2.5 mg/mL (Park et al., 2001), 발효 강황은 0.5~1 mg/mL (Ra and Kim, 2016) 이어서 O. lamarckiana 지상부의 메탄올 추출물의 S. aureus와 MRSA에 대한 항균력은 비교적 뛰어난 것으로 보인다. Kim et al. (2007)은 O. laciniata 전초 에틸아세테이드 분획물의 S. aureus에 대한 MIC가 10 μg/mL로 보고한 바 있어 O. lamarckiana 지상부 추출물의 분획물이 좀 더 강력한 항균효과를 보일 수도 있어 이에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다.

Fig. 2. Determination of the MIC of O. lamarckiana extract against S. aureus (A), MRSA (B) and B. cereus (C) and S. dysenteriae (D) by broth dilution test. A final optical density of the bacterial suspension was measured at 600 nm wavelength by spectrophotometry. DATA are presented as mean ± SD of three independent experiments. Means with different letters indicate the statistical difference (P<0.05).

Fig. 3. Growth curves of S. aureus (A), MRSA (B), B. cereus (C) and S. dysenteriae (D). Cultred at different concentration of O. lamarckiana. Bacterial growth was analyzed at the indicated time points by measuring values of 600 nm wavelength by spectrophotometry.

미생물에 오염된 식품의 섭취는 식중독과 같은 질병의 원인이 되기 때문에 식품의 장기 보관 및 유통을 위해 미생물의 성장을 억제하는 식품보존제의 개발은 국민들의 안전에 크게 기여할 수 있다. 본 실험에서 Oenothera 속 달맞이꽃 중 큰달맞이꽃(Oenothera lamarckiana)의 지상부 메탄올 추출물이 식품에 의한 감염질환과 관련 있는 박테리아 중 S. aureus, MRSA, B. cereus, S. dysenteriae에 대해 성장저해효과가 있음을 관찰하였다. 특히 S. aureus, MRSA에 대해서는 다른 식물의 총 추출물에 대해 상대적으로 강한 성장억제력을 보였다. 따라서 큰달맞이꽃 추출물에 항균력을 보이는 성분이 있을 것으로 생각된다. 이 실험은 큰달맞이꽃의 항균력에 관한 기초실험으로 향후 큰달맞이꽃에서 항균효과를 갖는 단일물질 탐색되어 식품의 보관 및 유통에 활용할 수 있을 것으로 기대한다.

This work was supported by Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET) through Future Innovation Food Technology Development Program, funded by Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA) (119023-3).

The authors have declared no conflict of interest.