
곤충이 발생되는 동안 중추신경계에서는 신경팹티드인 corazonin (
Corazonin은 세 가지 동형(isoforms)인 [Arg7], [His7], [Thr4, His7] corazonin이 곤충에서 확인되었다. [Arg7] - corazonin는 초파리(drosophila) (Veenstra, 1994), 나방(moths) (Hansen et al., 2001), 누에(silkworm), 귀뚜라미(crickets), 바퀴벌레(cockroach) (Hua et al., 2000)에서 보고되었고, [His7] - corazonin는 메뚜기(locusts)에서 동정이 되었다(Veenstra, 1991; Tawfik et al., 1999). 하지만 [Thr4, His7] 는 최근에 꿀벌(honey bee)에서 corazonin 유전자로 예측해서 보고가 되었다(Verleyen et al., 2006; Predel et al., 2007).
신경펩티드 corazonin은 반 생체 안 분석에서 매우 낮은 농도로 심장박동을 가속시키는 기능이 있었고, 이 결과로 곤충에서 심장박동을 조절하는 중요한 역할을 한다고 제안되었다. 하지만, 다른 곤충 및 다른 바퀴벌레종인
심장박동을 조절하는 corazonin의 활성은 시험관보다 생체 안에서 보다 많은 활성을 가진다고 하였다.
메뚜기에서는 corazonin이 매우 독특한 기능인 군집 상태를 촉진시키는 호르몬이라고 발표되었다(Tawfik et al., 1999). 군집성의
겉보기에 관련이 없는 기능들이 다양한 곤충 그룹에서 corazonin과 관련이 있는 것으로 보고되었다(Boerjan et al., 2010).
곤충에서 corazonin 뉴런의 발생 과정은 초파리를 포함한 쌍시류(Diptera) 또는 바퀴벌레, 나방, 딱정벌레 등에서 잘 연구되어 있다. 미국 바퀴벌레에서는 같은 쪽의 측심체(corpus cardiacum)에서 분비되거나 전대뇌(procerebrum) 측면에서 집합된 열 개의 신경내분비세포에서 corazonin 면역반응이 일어난다고 했다. 고성능액체크로마토그래피(high-performanced liquid chromatography, HPLC) 분석을 통하여 복부 신경절(abdominal ganglia)과 측심체(corpora cardiaca)에서의 면역양성 물질이 corazonin 이라는 사실이 확인되었다. 또한 서로 다른 시엽의 뉴런과 중대뇌(deutocerebrum)와 후대뇌(tritocerebrum)에서 쌍을 이루지 않는 개재뉴런(interneuron)이 식도하신경절(subesophageal ganglion)의 등쪽(dorsal) 중앙에서의 하나의 뉴런과 함께 명확하게 염색이 되었으나, 양성으로 염색된 식도하신경절은 종 특이적 인공산물일 것이라고 생각하였다(Veenstra and Davis, 1993; Baggerman and Schoofs, 2002). 하지만 메뚜기 종인
대표적인 여섯 개 곤충 종류(목)의 중추신경계의 세포에서 corazonin 뉴런 면역반응이 일어났으며, albino mutant인
나방 종인
이전 연구에서 scuttle fly의 애벌레 시기를 대상으로 중추신경계에서 발현된 corazonin 뉴런에 대해 관찰을 하였다. 2령 애벌레 시기에서 중추신경계 조직에 corazonin을 분비하고 생산하는 뉴런이 큰 범위에서 세 개의 그룹으로 관찰되었다. 중추신경계 대뇌 조직에서 전대뇌(procerebrum) 양쪽 시엽(optic lobe, OL) 부분에 위치하는 등측면(dorsolateral, DL) 가장자리 부위에서 세 개의 쌍으로 발현되는 corazonin 뉴런들이 강하고 뚜렷하게 관찰되었다. 그리고 대뇌 양쪽 조직 부분에서 맨 중앙 앞쪽과 근접한 부분의 등중앙(dorsomedial, DM) 부위에서도 한 개의 쌍으로 되어있는 corazonin 뉴런이 더욱 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 중추신경계 복신경색 조직 부분에서는 좌우가 상호 대칭으로 총 여덟 개의 쌍으로 되어있는 corazonin 뉴런이 강하고 뚜렷하게 발현되는 것을 관찰하였다. 중추신경계의 복신경색 조직에서 발현되는 여덟 개의 쌍으로 이루어진 corazonin 생산 뉴런은 좌측과 우측의 가장자리에서 대칭으로 발현되었다. 여덟 개의 쌍으로 이루어진 뉴런에서 가장 강하게 발현되는 뉴런이 관찰되었는데, 앞쪽 부분 두 개의 쌍이 뉴런 중에서 가장 강하게 corazonin이 발현이 되는 것을 관찰할 수 있었다. 중추신경계의 복신경색 조직을 측면 쪽에서 관찰했을 때 이 두 개의 쌍으로 구성되어 있는 뉴런은 또 다른 뉴런들의 쌍 보다 더욱더 등 쪽으로 가까이 위치하고 있는 게 특징이었다. 세 번째 부분의 뉴런 쌍을 포함한 이후의 corazonin 뉴런 쌍들은 거의 동일하게 위치하여 평면 상으로 좌측과 우측이 서로 대칭으로 위치하고 있었고, 가장 발현 강도가 낮은 뉴런은 마지막 가장 아래쪽에 있는 쌍에서 관찰되었다. Scuttle fly의 3령 애벌레 시기에서 중추신경계의 corazonin 분비 뉴런이 발현되는 것과 비교했을 때 애벌레 2령 시기와 거의 동일하게 관찰되었다. 하지만 대뇌 앞쪽의 등쪽 측면(DL) 부분에서의 corazonin 분비 뉴런 보다 대뇌 앞쪽의 등쪽 중앙(DM) 부분에서 한 개의 쌍으로 되어있는 뉴런의 발현이 점점 약해지고 애벌레 3령 후기에서 이러한 뉴런의 쌍이 거의 발현이 되지 않거나 관찰되지 않을 때도 있었다. 중추신경계의 복신경색 조직에서도 좌측과 우측이 서로 대칭으로 여덟 개의 쌍으로 구성되어 있는 corazonin 뉴런들 중에서 첫 번째와 두 번째 쌍 부분에서 corazonin 분비 뉴런이 강하고 뚜렷하게 발현되고 있었지만, 세 번째 쌍 부분 부터는 corazonin 분비 뉴런이 점점 아래쪽 끝 부분으로 갈수록 corazonin이 발현되는 정도가 점점 약해지고 있는 특징을 관찰할 수 있었다(Park, 2020).
본 연구에서는 이전 연구의 결과로 얻어진 scuttle fly 애벌레 시기의 중추신경계에서 발현되는 corazonin 뉴런과 비교하기 위해 번데기와 성충 시기에서 발현된 corazonin 뉴런을 연구하여 이미 연구되어진 동일 초파리 종인
실험에 이용한 scuttle fly는
Scuttle fly을 번데기(pupae) 시기 1~3일, 4~6일, 7~9일, 10~12일, 13~15일 그리고 성충(adult) 시기별로 각각 5개 이상의 개체를 사용하였다. 0.1% tween 20이 포함되어 있는 PBS (phosphate buffer solution, pH 7.0)가 채워져 있는 홈이 파인 슬라이드에 개체를 담근 상태로 실체현미경(stereomicroscopy) 상에서 가늘고 정밀한 핀셋을 이용하여 번데기, 성충의 껍질 부분을 찢어가면서 채취하였고, 중추신경계 조직인 대뇌와 복신경색 조직을 적출하여 그 형태를 관찰하였다. 발생 단계별로 채취된 중추신경계 조직을 4% paraformaldehyde 용액에 넣은 후 4℃ 냉장고에 1시간 이상 고정하여 보관하였다.
제자리혼성화법(ISH)으로 corazonin을 검출하기 위해 RNA probe를 제작하였다. 먼저 scuttle fly의 DNA를 phenol /chloroform 법으로 추출하였다. Primer는 corazonin gene의 특이한 염기서열을 선택하고 primer의 앞 부분에는 subcloning에 필요한 제한효소 부위를 추가하여 주문 제작하여 PCR을 시행하였다(Table 1). PCR의 조성은 10X PCR buffer 2 μL, 10 mM
Base sequences of primers used for PCR amplification in scuttle fly of corazonin gene
Name of primers | Sequences (5' → 3') |
---|---|
5'-cgaagcttGAGTCGTATTCCGATATTC | |
5'-ggtctagaCTTCAAATGCGAAACCACA |
증폭 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector (Promega Corporation, Madison, WI, USA)에 삽입하여 T7 프로모터를 연결하였다. 이 백터를 주형으로
제작된 corazonin RNA Dig-probe의 조직 침투 효율성을 높이기 위해서 fragmentation 과정을 실시하였다. 먼저 Dig-labeling 된
그 다음으로 nucleotide 조각을 제거하고 RNA의 농축을 위해서 0.1 volume의 5 M LiCl와 2.5 volume의 100% Ethanol을 넣고 -70℃에서 30분간 침전 후 4℃에서 15분간 12,000 g로 원심분리 하고 70% ethanol를 이용하여 수세를 실시하였다. 침전된 RNA는 5분 동안 공기 중 상태에서 말린 후 hydrolysis buffer (40 mM NaHCO3/60 mM Na2CO3, pH 9.2~10.2)에 넣고 60℃에서 10분간 fragmentation을 실시하였다. 마지막으로 10 μL의 1 M Tris (pH 7.5), 300 μL의 in situ hybrix buffer, 그리고 1 μL의 RNase inhibitor를 넣고 -20℃ 보관하여 사용하였다.
4% paraformaldehyde 용액에 고정된 중추신경계 조직을 먼저 PBTw (0.1% tween 20 in phosphate buffer solution, pH 7.0)로 충분히 수세하여 고정액을 완전히 제거하였다. 고정액이 제거된 다음 평형 형성(equilibration)을 시키기 위해 실온에서 PBTw : hybrix (1:1)로 반응시킨 다음 60℃에서 3~4시간 정도 hybrix 용액(50% deionised formamide 50 mL, 5X SSC 25 mL, 100 μg/mL tRNA 0.5 mL, 100 μg/mL ssDNA 1 mL, 50 μg/mL Heparin 45 μL, 0.1% Tween-20, 1 mL, dH2O 22.5 mL)에 전혼성화(prehybridization) 시켰다.
전혼성화가 끝나기 전에 미리 탐침(probe)을 100℃에서 10분 정도 변성(denature)시킨 후 바로 얼음물에 3분 이상 담가서 다시 회복되지 못하게 하고 60℃에 반응시킨 전혼성화 용기에 탐침(probe)를 혼합하여 12~14시간 정도 반응시켜 혼성화(hybridization) 시켰다. 혼성화가 끝나면 hybrix와 PBTw의 비율을 tube에 5:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4, 0:5로 미리 만들어 60℃로 담가둔 후 단계별로 10분 동안 60℃ 온도 상태에서 반응을 시킨 후, 실온에서 PBTw로 깨끗이 다시 한번 수세를 하였다. 비특이적인 반응을 차단하기 위하여 정상 동물 혈청인 BSA (bovine serum albumin)와 NSS (normal sheep serum)를 PBTw에 일정량을 희석하여 2시간 동안 blocking 단계를 시행하였고, 반응이 끝난 후 blocking 시약을 제거한 후 PBTw에 항체(anti-digoxigenin-AP Fab fragments, Roche Diagnostic, Germany)를 1:000으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰다.
항체반응이 끝난 후 PBTw에 여러 번 수세하고 검출 완충액(detection buffer, pH 9.5)를 반응 시킨 후 alkaline phosphate (AP) 기질(substrate)인 NBT/BCIP 저장 용액(Roche Diagnostics, Germany)과 검출 완충액을 1:100 희석하여 20분 간격으로 발색되는 것을 실체현미경으로 관찰하였고, 발색이 완료되었을 때 PBTw으로 반응을 정지시키고 철저하게 수세를 하였다.
제자리혼성화법이 완료된 중추신경계의 조직은 glycerin을 PBTw에 각각 50%, 70% 농도 단계를 거쳐서 중추신경계 조직을 올바른 방향으로 슬라이드에 위치시킨 후 cover glass로 봉입한 후 광학현미경(light microscopy, LEICA ICC50 HD, Germany) 상에서 관찰하여 사진을 촬영하였다.
번데기(pupae) 시기에서 중추신경계 조직의 corazonin 생산 뉴런의 발달은 애벌레에서 번데기로 변태가 이루어지면서, 중추신경계 조직에서 corazonin 뉴런은 두 개의 그룹이 사라지고 한 개의 그룹에서만 계속해서 corazonin을 발현하였다. 애벌레 시기에서 corazonin을 발현하던 전대뇌 등중앙(DM) 양쪽 한 쌍과 복신경색에 존재하는 여덟 쌍의 corazonin 뉴런이 번데기로 변태가 이루어짐과 동시에 사라져 버리는 것을 볼 수 있었다. 반면 시엽 근처의 전대뇌 등측면(DL) 부분에 corazonin 뉴런 세 쌍은 여전히 뚜렷하게 corazonin을 발현하고 있었다(Fig. 2). 이 세 쌍의 corazonin 뉴런은 번데기 시기 내내 그 발현 양상을 유지하였으며 시엽이 발달할수록 중앙으로 수렴되어 번데기 말기에는 거의 중앙 부위에 위치하였다. 사라진 등중앙(DM) 뉴런 쌍과 복신경색의 뉴런 여덟 쌍은 번데기 시기의 어느 단계에서도 다시 나타나지 않았다(Fig. 3-6).
성충(adult fly) 시기에서 중추신경계 조직의 corazonin 생산 뉴런의 발달은 대뇌 중앙으로 이동한 세 쌍의 등측면(DL) corazonin 뉴런들은 성체에서 거의 정중앙에 좌우로 배치되었다(Fig. 7A, B). 하지만 성충 시기의 중추신경계에서의 발현된 corazonin 뉴런을 살펴보았을 때, 대뇌 조직의 등측면(DL)에서 발현된 corazonin 뉴런 세 쌍이 전대뇌 앞쪽 중앙 뇌간부 (pars intercerebralis)에 집합되어 존재하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 7C, D). 그리고 번데기 시기와 마찬가지로 애벌레 시기에 corazonin 뉴런이 발현되었던 전대뇌 등중앙(DM) 양쪽 가장자리 부분의 한 쌍과 복신경색의 여덟 쌍이 존재하지 않는 것도 확인하였다. 애벌레나 번데기 시기에 비해서 중추신경계 조직에 신경섬유가 많이 증가되어 있어서 배경은 깨끗하지는 않았다(Fig. 7).
초파리와는 달리 성체의 뇌에서 corazonin 뉴런의 수는 더 이상 늘어나지 않았다. 처음부터 corazonin을 생산하던 세 쌍의 뉴런들만이 성체에서도 corazonin을 발현하면서 그 기능을 유지하였다(Fig. 7).
Scuttle fly의 애벌레 2, 3령 시기에서 중추신경계 대뇌 조직과 복신경색 조직을 채집해서 제자리혼성화(ISH) 검사 방법을 통하여 corazonin 분비 뉴런 유전자의 발현 유무 정도를 관찰하여 확인하였다. Corazonin 뉴런은 애벌레 2, 3령 시기의 중추신경계 대뇌 조직에서 등쪽 중앙(DM) 한 개의 쌍, 등쪽 측면(DL) 세 개의 쌍, 복부신경색 조직에서 좌측과 우측 대칭인 여덟 개의 쌍으로 존재하는 것을 관찰함으로써, 중추신경계에서 corazonin을 분비하는 뉴런이 대뇌와 복신경색 조직에서 크게 세 개의 그룹에서 발현되고 있는 것을 확인하였다(Park, 2020). 하지만 애벌레에서 번데기로 변태가 되는 동안에, corazonin 발현 패턴에 크게 변화가 이루어진다.
Scuttle fly에서도
한편, scuttle fly에서 전대뇌 양쪽 등측면(DL) 부분에서 세 쌍의 발현되는 corazonin 뉴런은
Scuttle fly를 비롯해서 특히 완전변태의 곤충에서 중추신경계(CNS)의 수많은 뉴런과 함께 대부분의 애벌레 조직은 세포의 죽음 프로그램(programmed cell death, PCD)에 의해 제거되는 동안 극적으로 성충 특정 조직과 뉴런에 의해 신생된 조직과 신경세포를 새로이 형성하게 된다고 보고되었다(Riddiford, 1993; Truman et al., 1993; Truman et al., 1994). 이러한 발생학적인 현상에 의해서 조직이 세포분열 하여 새로이 만들어지거나 또는 생리적인 현상에 의해 세포자연사에 의해서 없어지기도 한다고 하였다. 이러한 현상은 발생학적으로 조절하는 어떠한 물질들이 활성화 되거나 억제되면서 이루어진다고 보고가 있었다(Shi, 2002; Hay and Guo, 2006). 그래서 corazonin 발현 뉴런이 극적인 발생 과정 중에서 제거가 되고 생성이 되는 것은 세포자연사에 의한 생리적인 현상이라고 추측할 수 있었다.
This study was supported by reserch fund Mokpo Science University, 2021.
The authors affirm that they have no academic, financial or rights interests.