
의료기술의 발달로 인한 평균수명 증가와 함께 인구 고령화가 진행됨에 따라 인공관절에 대한 수요가 급증하고 있다. 국내 인공관절 시장규모는 2022년 1,228억원에서 2024년에는 1,280억원 규모가 될 것으로 전망되고 있다 (1). 특히 관절염과 같은 만성 퇴행성 질환의 발생 빈도가 증가하면서 인공관절의 필요성은 더욱 커지고 있다. 인공관절 제작에 사용되는 생체용 재료는 금속재료, 세라믹재료, 고분자재료로 분류할 수 있으며 인공관절의 기능적 요구사항에 맞추어 사용되고 있다. 금속재료인 티타늄 합금(Ti-6Al-4V)과 코발트-크롬 합금(Co-Cr)은 높은 기계적 강도와 내구성, 부식 저항성을 특징으로 하며 인체와의 생체적합성이 우수하고 장기간 사용 가능하다는 장점이 있다 (2). 하지만 뼈와의 접합성이 다소 떨어질 수 있고 금속성 피로에 의한 손상 위험이 존재한다는 단점이 있다. 세라믹 재료인 알루미나(Al2O3), 지르코니아(ZrO2)는 낮은 마찰계수와 높은 내마모성을 특장점으로 갖고 있지만 충격에 약해 깨질 위험이 높아지는 단점이 있다 (3). 고분자 재료인 폴리에틸렌, 폴리우레탄은 충격 흡수 능력이 우수한 소재로 유연성과 화학적 안정성이 뛰어나다는 장점이 있으나 기계적 강도나 낮아 장기간 사용 시 마모로 인한 손상이 발생할 수 있다는 단점이 존재한다 (4). 위에서 언급한 바와 같이 인공관절의 제작을 위해 다양한 소재들이 널리 사용되고 있지만 소재에 따라 여러 가지 단점들이 존재하기 때문에 이러한 단점을 극복할 수 있고 높은 생체적합성을 갖는 소재의 개발이 필요하다.
3D 프린팅은 인공관절 제작에 사용되는 최첨단 제조 기술로, 분말소재를 레이저 또는 전자빔으로 녹여 층층이 쌓아 인공관절을 형성하는 방식이다. 기존 절삭용 인공관절 제작이 갖는 복잡한 공정(절삭가공, 주조 등)으로 인한 늘어나는 가공시간을 단축시키고 원가를 절감할 수 있으며 국내환자 체형에 맞는 복잡하고 미세한 구조의 형상을 정확하게 구현할 수 있어 환자 맞춤형 인공관절 제작이 가능하다는 장점이 있어 최근 들어 활용도가 높아지는 추세에 있다.
본 연구에서는 3D 프린팅을 활용한 인공관절 제작을 위해 높은 내마모성과 내충격성, 낮은 마찰계수 등 우수한 물리적 특성을 갖는 것으로 알려진 초고분자량 폴리에틸렌(ultra-high molecular weight polyethylene, UHMWPE)의 생체적합성을 평가하였다. 국제표준화기구(International Standards Organization)에 따르면, UHMWPE는 mole 당 분자량이 최소 1백만 g/mole이며 중합도가 36,000인 폴리에틸렌이다 (5). UHMWPE는 반결정성 고분자로, UHMWPE의 물리적 특성은 비결정질과 결정질 상태의 연결성에 의해 결정된다 (6). UHMWPE는 높은 기계적 강도와 탄성률, 뛰어난 내화학성 및 내구성 등의 특성을 가지고 있는 재료이다. 이러한 특성으로 인해 다양한 산업분야에서 UHMWPE의 활용도가 높아지고 있으며, 특히 척추 임플란트, 수술용 봉합사, 멤브레인, 폴리머 에어로젤 등 의과학 분야에서 그 적용 점위가 더욱 확대되고 있는 추세이다 (7,8).
이를 위해 Gruber and Nickel (9)가 제안한 방식에 따라 UHMWPE의 세포독성을 기존에 널리 사용되고 있는 금속재료인 순수 티타늄(Pure-Ti), 티타늄 합금(Ti-6Al-4V)과 비교하여 UHMWPE의 3D 프린팅 인공관절용 소재로써의 적합성을 검증하고자 하였다.
실험에 사용한 소재로는 양성 대조군으로 구리합금, 음성 대조군으로 폴리에틸렌 필름, 세포 독성 평가를 위해 UHMWPE, 순수 티타늄(Pure-Ti), 티타늄 합금(Ti-6Al-4V) 시편을 각각 사용하였으며 시편은 5 mm × 5 mm × 2 mm의 크기를 갖는 디스크 형태로 제작하였다. 사용 전 121℃, 15기압, 20분의 조건으로 멸균처리를 시행한 후 (10), 사용 전 70% 에탄올로 표면을 다시 세척한 후 실험에 사용하였다.
세포 독성 평가 및 생존률 분석을 위한 세포주(cell line)로 ISO 10993-5에서 권고하는 기준에 따라 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 L-929 마우스 섬유아세포를 분양 받아 사용하였다. 세포 배양을 위해 10% Fetal bovine serum (FBS)가 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma)에 Penicillin-Streptomycin (Gibco)을 각각 100 units/mL, 100 μg/mL이 되도록 첨가하여 사용하였다 (11).
5 × 104개의 L-929 세포를 직경 100 mm culture dish에 넣고 여기에 DMEM 배지 10 mL를 첨가 후 5% CO₂, 37℃ 조건에 24시간 동안 배양하였다. Nikon ECLIPSE TS100을 이용해 세포가 70%의 세포 밀도에 도달했는지 확인 후 48℃의 3% agarose 10 mL를 세포 배양액과 1:1의 비율로 혼합하였다 (12). 30분간 배양기에서 반응시켜 고화시킨 배지에 Dulbecco’s phosphate buffered saline modified (DPBS, Welgene)와 neutral red vital stain (Sigma)을 99.7:0.3의 비율로 혼합하여 5 mL를 천천히 첨가하고 염색약이 전체적으로 퍼지도록 한 뒤 다시 CO₂, 37℃ 조건에 30분간 배양하였다. Neutral red vital stain을 제거 후 양성 대조군인 구리합금, 음성 대조군인 폴리에틸렌 필름, UHMWPE 시편, Pure-Ti 시편, Ti-6Al-4V 시편을 동일한 culture dish 내에서 평균 20 mm 이상의 간격을 유지하여 한천에 밀착되도록 부착한 뒤 다시 24시간 동안 배양하였다. 시편 주변에 생성된 배지 탈색 범위의 크기를 버니어 캘리퍼스로 이용하여 측정하고 zone index를 구하였다. 또한 도립 현미경을 이용하여 탈색 부위에서 세포가 용해된 비율을 계산하였다. 시편 디스크 주변의 탈색된 세포의 비율을 측정하기 위해 디스크 상, 하, 좌, 우에서 무작위로 세포 사진을 찍은 후 전체 세포 중에서 neutral red 염색액이 탈색된 세포의 비율을 계산하였다. Zone index와 lysis index는 Table 1의 기준에 근거하여 산출되었다. Cell response는 Table 2와 같이 zone index와 lysis index를 우선 도출한 후 두 개의 index 중에서 더 큰 세포 반응값을 선택하여 결정하였다 (13). 모든 실험은 3회 반복 시행하였다.
Criteria and decolorization for zone and lysis index
Index | Decolorization of zone and lysis index |
---|---|
Zone | |
0 | No detectable decolorization zone around or under specimen |
1 | Decolorization zone limited to area under specimen |
2 | Decolorization zone extends less than 0.5 cm beyond specimen |
3 | Decolorization zone extends 0.5 cm to 1.0 cm beyond specimen |
4 | Decolorization zone extends further than 1.0 cm beyond specimen but dose not involve entire dish |
5 | Decolorization zone involves entire dish |
Lysis | |
0 | No observable cytotoxicity |
1 | < 20% of the decolorized zone affected |
2 | 20% to 40% of the decolorized zone affected |
3 | 40% to 60% of the decolorized zone affected |
4 | 60% to 80% of the decolorized zone affected |
5 | > 80% of the decolorized zone affected |
Criteria for cell response
Scale | Cell response | Interpretation |
---|---|---|
0 | 0 | Non-cytotoxic |
1 | 1 | Mildly cytotoxic |
2 | 2–3 | Moderately cytotoxic |
3 | 4–5 | Severely cytotoxic |
세포 생존률 측정을 위해 MTT (3’-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay를 실시하였다. 48 well plate에 4 × 104개의 L-929 세포 100 μL를 분주하고 24시간 배양 후 배양액을 제거하였다. 그 후 각 well에 UHMWPE 시편, Pure-Ti 시편, Ti-6Al-4V을 각각 추가하였고 다시 24시간 동안 배양하였다. 음성 대조군으로는 배양액 100 μL를 넣어 사용하였다. 24시간 후 모든 well에서 금속 시편을 제거하였고 금속 시편이 제거된 well에 50 μL/mL 농도의 MTT 시약(Sigma)이 포함된 배양액을 각각 200 μL를 넣은 후 세포배양기에 다시 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 완전히 제거한 후 모든 well에 200 μL의 dimethyl sulfoxide (Sigma)를 넣고 5분간 실온에 방치하였다. 흡광도 측정은 Filter Max F5 Multi-Mode Microplate Reader를 사용해 595 nm의 파장에서 실시하였다(Filter Max F5, Molecular Devices) (14).
모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현되었다. 양성 대조군, 음성 대조군 및 3개 시편의 세포독성 평가를 위해 일원분산분석(One-way ANOVA)를 수행하였으며, 사후 분석을 위해 Bonferroni 검정을 적용하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc.)을 사용해 이루어졌으며
한천중층시험법은 고체 한천배지를 투과하는 시험물질의 독성 성분에 의한 탈색 정도와 세포사멸을 유발하는 정도를 평가하여 시험 재료의 세포 독성을 확인할 수 있는 시험법이다. L-929 세포를 이용한 한천중층시험법 시행 결과 양성 대조군으로 사용한 구리합금 주변에서는 뚜렷한 탈색환(decolorization zone)이 관찰되었다(Fig. 1). 반면 음성 대조군으로 사용한 폴리에틸렌 필름의 경우에는 탈색환이 관찰되지 않고 neutral red의 염색성이 잘 보존되어 한천중층시험법이 적절히 수행되었음을 확인할 수 있었다. UHMWPE 시편, Pure-Ti 시편, Ti-6Al-4V 시편 모두 시편 주변 부위에 탈색환이 관찰되지 않았다. Lysis index를 평가한 결과 양성 대조군인 구리 시편의 경우 뚜렷한 세포 용해도를 나타낸 반면, 음성 대조군인 폴리에틸렌 필름과 UHMWPE 시편, Pure-Ti 시편, Ti-6Al-4V 시편 모두 lysis index가 0으로 나타나 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다(Fig. 2). Cell response는 UHMWPE 시편, Pure-Ti 시편, Ti-6Al-4V 시편 모두 0으로 판정되었다(Table 3).
Results of zone index, lysis index, cell response scale, and interpretation of cytotoxicity of PC, NC, UHMWPE, Pure-Ti, and Ti-6Al-4V
Specimens | Zone index |
Lysis index |
Scale | Cytotoxicity |
---|---|---|---|---|
PC | 4 | 3 | 3 | Severely cytotoxic |
NC | 0 | 0 | 0 | Non-cytotoxic |
UHMWPE | 0 | 0 | 0 | Non-cytotoxic |
Pure-Ti | 0 | 0 | 0 | Non-cytotoxic |
Ti-6Al-4V | 0 | 0 | 0 | Non-cytotoxic |
PC, positive control; NC, negative control; UHMWPE, ultra-high molecular weight polyethylene.
세포 배양액만을 처리한 control 대비(100% 생존율) UHMWPE 시편을 처리한 세포의 생존율은 88.5%, Pure-Ti은 85%, Ti-6Al-4V은 83%로 나타났으며 또한, 3개 시편 사이에서의 세포 생존율의 차이가 관찰되지 않아 기존에 사용되고 있는 금속재료와 비교했을 때도 UHMWPE의 세포독성이 없는 것으로 확인되었다(Fig. 3).
본 연구에서는 재료의 생체적합성 평가를 위한 기준에 근거하여 마우스 섬유아세포인 L-929를 이용해 UHMWPE 시편의 세포독성을 평가하였고 이 결과를 기존에 사용되고 있는 Pure-Ti 시편, Ti-6Al-4V과 비교하여 3D 프린팅 기술을 활용한 인공관절 제작에 있어 UHMWPE의 적합성을 확인하고자 하였다. 한천중층시험법과 MTT assay 결과에 따르면, UHMWPE 시편에서는 뚜렷한 세포 독성이 관찰되지 않았고 기존 시편들과 비교했을 때도 유의한 차이가 없어 인공관절을 위한 3D 프린팅의 소재로 사용하기에 적합한 것으로 확인되었다.
먼저, 한천중층시험법에서 UHMWPE, Pure-Ti, Ti-6Al-4V 모두 시편 주변에서 탈색환(decolorization zone)이 관찰되지 않았으며, lysis index 또한 0으로 나타나 세포 독성이 없는 것으로 확인되었다. 양성 대조군인 구리 합금 시편에서 뚜렷한 탈색환과 세포 용해가 관찰된 것과 비교했을 때, UHMWPE는 세포와의 접촉에서 매우 안정적인 생체적합성을 보였다. 이는 음성 대조군으로 사용한 폴리에틸렌 필름과 유사한 결과로, UHMWPE가 인체 내에서 장기적으로 안전하게 사용될 수 있음을 시사한다. 또한 MTT assay 결과에서도 UHMWPE, Pure-Ti, Ti-6Al-4V 세포의 생존율이 각각 89%, 86%, 84%로 나타났으며, 대조군 대비 통계적으로 유의미한 차이는 없었다. 이는 금속 재료인 티타늄 합금과 비교해도 UHMWPE가 세포 생존율에서 비슷한 수준의 결과를 나타낸다는 점에서 한천중층시험법의 결과를 뒷받침한다.
3D 프린팅 기술의 발달로 인해 의료, 기계, 건축, 패션 등 다양한 산업 분야에서 3D 프린팅이 활용되고 있다. 3차원 형상을 적층 방식으로 제작하는 3D 프린팅 기술은 파우더 베드 융합(powder bed fusion), 지향성 에너지 증착(directed energy deposition), 바인더 젯팅(binder jetting)과 같은 주요 기술이 사용되고 있으며 (15), 복잡한 형상 제작이 가능하고 재료 절감의 효과가 있으며 기존 제조 공정의 제한이 없는 보다 자유로운 설계가 가능하다는 점에서 전통적인 제조 산업 분야인 항공우주, 자동차, 에너지 산업 외에도 의료기기 산업에도 널리 활용되고 있다. 의료 분야에서 3D 프린팅에 가장 널리 사용되는 티타늄은 고강도, 내식성, 생체 적합성 등 다양한 장점을 가지고 있지만 대부분 수입에 의존하고 있으며 고가의 원소재로 인하여 적용할 수 있는 부분이 제한적이라는 단점이 있다. 특히 인공관절물에 적용 시 금속-금속 관절면에서 금속 마모입자가 발생할 수 있고 금속 마모입자는 큰포식세포(macrophage)와 거대세포(giant cell)에 의해 탐식되어 용해소체(lysosome)에 의해 부식될 수 있다. 이로 인한 세포 내 금속 이온의 증가는 세포 괴사를 초래하여 염증반응과 골용해가 촉발되는 부작용이 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다 (16). UHMWPE는 분자량이 1백만 이상인 폴리에틸렌의 한 종류로 고강도 및 내충격성, 내마모성, 저밀도, 자체 윤활성과 같은 우수한 물리적 특성으로 인해 운송 및 물류, 기계 부품, 방탄 소재 등 다양한 산업 분야에서 널리 활용되고 있는 비금속 소재이다 (17). 그러므로 UHMWPE 소재의 사용을 통해 3D 프린팅 기술을 이용한 인공관절 제작에 있어 기존 금속 기반 인공관절이 갖고 있는 피로와 마모로 인한 장기 사용의 문제점을 개선할 수 있을 것으로 기대한다.
MTT assay 결과에서 control 대비 UHMWPE의 cell viability가 다소 감소한 것으로 나타났지만 다른 소재와 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 이는 UHMWPE 소재의 세포독성 때문이라기보다는 MTT 시행 시 세포 부위에 시편을 접착하고 때어내는 과정에서 생기는 세포 탈락 현상 때문으로 보인다 (18).
본 연구에서는
결론적으로, UHMWPE 소재가 3D 프린팅을 통한 인공관절 제작에 적합한 재료임을 확인하였으며, 향후 UHMWPE의 응용 가능성을 고려한 추가 연구가 이루어져야 할 것이다. 이를 통해 인공관절의 수명 연장과 환자 맞춤형 의료기기 제작에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
None.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This research was supported by "Regional Innovation Strategy (RIS)" through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (MOE) (2021RIS-001[1345370811]). The funders have no role in the study.
Conceptualization: YMS, DWY. Data curation: SLY, DBL. Formal analysis: SLY, DBL, DWY. Funding acquisition: YMS, DWY, THY. Investigation: SLY, DBL, MGP, JYL, CWS. Methodology: SLY, DBL, MGP, JYL, CWS. Supervision: YMS, DWY. Visualization: SLY, DBL. Writing – original draft: SLY, DBL. Writing – review and editing: YMS, DWY.