
Statistics Korea (2021)에서 제공하는 암 발생 및 사망 현황에 따르면, 대장암의 조발생률은 최근 10여 년 동안 감소하는 추세를 보이고 있으나, 2019년 기준 조사망률은 폐암과 간암 다음으로 여전히 높은 것으로 나타났다. 이러한 대장암은 적색육과 가공육의 높은 섭취량과 섬유질이 풍부한 과일, 채소, 곡물 및 유제품의 낮은 섭취량, 지나친 음주량 및 운동 부족 등의 원인으로 인해 발생한다(Shannon et al., 1996; Corpet, 2011; Bouvard et al., 2015; Friedenreich et al., 2016; Na and Lee, 2017; Gianfredi et al., 2018).
지금까지 수술적 절제술, 화학요법, 면역치료 및 방사선치료 등과 같은 여러 치료 방법들의 발달로 인해 대장암 환자들의 5년 생존율은 증가되었으며, 수술에 따른 사망률과 합병증은 감소되었다(David et al., 2010; Jeong, 2010). 하지만, 대장암 치료를 받은 환자들의 대다수가 재발에 대한 두려움과 후유증을 겪고 있으며, 수술을 하는 동안 암세포가 다른 기관으로 전이되거나 침윤이 될 수 있고, 암의 성장과 혈관신생 등의 부작용으로 인해 보다 나은 치료 방법을 찾는 과정이 필요하다(Ceelen et al., 2014; Dariya et al., 2018).
복어독으로 알려진 tetrodotoxin (TTX)은
하지만, 장기간에 걸쳐 많은 연구들이 진행되었음에도 불구하고 TTX를 치료제로 사용하기 위한 정보들은 아직 부족하며, TTX의 처리가 어떤 유전자들의 발현에 변화를 일으킴으로써 이러한 반응들을 유도하는지에 대한 연구 또한 이루어지지 않았다. 따라서, 본 실험에서는 SW620 세포에 TTX를 처리하였을 시 관여하는 메커니즘이 무엇인지를 확인하기 위해 유세포 분석(FACS), RNA 염기서열 분석(RNA-seq) 및 실시간 정량적 PCR (qRT-PCR)을 진행함으로써 암에 대한 치료제로써 TTX의 활용 가능성을 평가하였다.
TTX는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였으며, sodium citrate (BioShop, Burlington, ON, Canada)를 pH 4.8, 20 mM의 농도로 3차 멸균수에 용해시켜 얻어진 buffer에 녹여 10 mM 농도의 저장액을 만들었다. 만들어진 저장액은 aliquot하여 -20℃에서 보관하였다.
SW620 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA), 100 units/mL penicillin 및 100 mg/mL streptomycin (Welgene, Daegu, Korea)이 함유된 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Welgene) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건의 세포배양기에서 배양하였다. SW620 세포를 이용한 실험들은 강원대학교 생명윤리위원회의 심의면제승인(KNUIRB-2022-03-010)을 받았다.
MTT assay는 CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하였으며, Lee 등 (2018)이 사용한 방법을 일부 수정하여 진행하였다. 먼저, 1차 배양에서 얻은 세포를 96-well cell culture plate (SPL Life Sciences, Seoul, Korea)에 2×104 cells/well의 농도로 seeding하여 24시간 동안 배양하였다. 세포가 plate에 부착되면 배지를 제거하고, TTX가 0, 1, 10 및 100 μM의 농도로 함유된 새로운 배지를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 48시간 후에 다시 배지를 제거하고, 새로운 배지 50 μL와 dye solution 15 μL를 첨가하여 다시 4시간 동안 배양하였다. 그 후, solubilization/stop solution 100 μL를 각 well에 첨가한 다음 1시간 동안 추가로 배양하였다. SpectraMax M4 microplate reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA)로 570nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 SW620 세포의 증식을 계산하였다.
다양한 FACS 기술 중 annexin V-propidium iodide staining 방법을 통해 apoptosis를 관찰하였다. 실험은 eBioscienceTM Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC (eBioscience, Ltd., San Diego, CA, USA)를 사용하여 진행하였다. 먼저, 세포를 6-well cell culture plate (SPL Life Sciences)에 2×105 cells /well의 농도로 seeding하여 24시간 동안 배양하였다. 세포가 plate에 부착되면 배지를 제거하고, TTX가 0 및 100 μM의 농도로 함유된 새로운 배지를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 48시간 동안 배양을 한 후 세포를 harvest한 다음 원심분리하여 상등액을 제거하고, Dulbeccós phosphate -buffered saline (DPBS, Welgene)으로 세척을 진행하였다. 그 후, 1X annexin V binding buffer에 부유시킨 다음 annexin V FITC와 propidium iodide staining solution을 첨가한 후 암실에서 15분 동안 반응시켰다. 반응시킨 세포는 BD FACSAria II (Bectom Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 annexin V-positive apoptotic cell의 비율을 측정하였다.
RNA-seq을 위해 100 mm cell culture dish (SPL Life Sciences)에 2×106 cells/dish의 농도로 세포를 seeding한 후 24시간 동안 배양한 후 세포가 dish에 부착되면 배지를 제거하고, 48시간 동안 0 및 100 μM 농도의 TTX가 함유된 새로운 배지를 첨가하여 배양하였다. 그 다음, 세포를 harvest한 후 원심분리하여 상등액을 제거하고, DPBS로 세척을 진행하였다. Total RNA는 TRIzol® Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 추출하였으며, 이에 대한 염기서열 분석은 LAS Biotechnology (Seoul, Korea)에 의뢰하여 수행하였다.
Total RNA는 위와 동일한 조건으로 세포를 배양한 후 TRIzol® Reagent를 사용하여 추출하였다. 추출된 RNA의 농도와 순도는 NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였다. iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 500 ng의 total RNA로부터 cDNA를 합성하였으며, PowerUPTM SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific)와 0.4 pM의 기능성 유전자에 대한 특이적 프라이머들을 사용하여 20 μL의 reaction volume에서 qRT-PCR을 진행하였다. 사용했던 프라이머들에 대한 정보는 Table 1에 제시하였다. 분석은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 수행하였다.
Information and sequence of functional primers for qRT-PCR
Genes | Sequence | Tm (℃) | Product size (bp) | Accession No. |
---|---|---|---|---|
F: GGGCAAGGTGGAACAGTTAT | 60 | 138 | NM_005252.4 | |
R: AGTTGGTCTGTCTCCGCTTG | ||||
F: TTGCCACTGTTACAGGCAGA | 60 | 119 | NM_015965.7 | |
R: AACACAGACTCCCCCACCTT | ||||
F: GCAGAACTTGATGCTGTCCA | 60 | 159 | NM_001317777.1 | |
R: GCCTCTAGCCTCTGCACAC | ||||
F: AGAGGAAACTTCGGACCACG | 60 | 128 | NM_080430.4 | |
R: CGGCTCTCAGCAAGAGAAGT | ||||
F: AGAAGTACAACCGAAATGGAGTC | 60 | 169 | NM_020839.4 | |
R: ACAATGTCGTTTACCCAATCAGT | ||||
F: GGCTTCCGAGAGACAGAGAA | 62 | 171 | NM_032306.4 | |
R: GCAGAACTTGATGCTGTCCA | ||||
F: CTGCACCACCAACTGCTTAG | 60~62 | 108 | NM_002046.7 | |
R: GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT |
모든 실험들은 세 번씩 반복 진행하였으며, 이에 대한 결과는 평균 ± 표준오차(SEM)로 계산하였다. TTX 미처리군(대조군)과 TTX 처리군 간의 차이는 SAS software ver. 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA)의 분산분석(ANOVA), 일반선형모형(GLM) 및 Duncan 다중범위검정을 사용하여 결정하였으며,
TTX가 SW620 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 TTX를 48시간 동안 각각 0, 1, 10 및 100 μM 농도로 처리한 후 MTT assay를 진행하였으며, 그 결과를 Fig. 1에 제시하였다. SW620 세포의 증식은 1 μM 농도에서 88.35% (
TTX의 처리에 의해 SW620 세포의 증식이 감소되는 것으로 확인되었기 때문에 세포증식의 감소가 apoptosis의 유도와 연관이 있을 것으로 기대되어 annexin V-propidium iodide staining을 진행하였다. 48시간 동안 TTX를 0 및 100 μM의 농도로 처리한 후 annexin V-positive apoptotic cell들의 비율을 측정하였다. 대조군에 비해 100 μM 농도의 TTX 처리군에서 apoptosis가 시작된 세포들의 비율은 5.205%에서 6.605%로, apoptosis가 진행되어 죽은 세포들의 비율은 7.335%에서 8.23%로 증가되는 것으로 확인되었으나, 유의미한 차이는 나타나지 않았다(Fig. 2). 따라서, TTX의 처리는 apoptosis를 유도하여 SW620 세포의 증식에 영향을 미치기는 하지만, 이보다는 다른 메커니즘에 의한 영향을 더 많이 받는 것으로 판단하여 RNA-seq을 진행함으로써 TTX를 처리하였을 시 나타나는 차등발현 유전자(differentially expressed gene, DEG)들을 확인하였다.
대조군과 TTX 처리군의 RNA-seq을 통해 확인된 유전자들의 수는 총 19,389개였다. 이 중,
UP- and down-regulated genes in 100 μM TTX-treated SW620 cells compared with control
Official gene symbol | Full description | Log2FC | ||
---|---|---|---|---|
Up | ||||
Fos proto-oncogene, AP-1 transcription factor subunit | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:3796] | 1.102 | 0.00005 | 0.00295 | |
Zinc finger AN1-type containing 4 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:23504] | 1.082 | 0.00005 | 0.00295 | |
Family with sequence similarity 8 member A1 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:16372] | 1.03 | 0.00005 | 0.00295 | |
WD repeat domain 48 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:30914] | 1.008 | 0.00005 | 0.00295 | |
Zinc finger CCCH-type containing, antiviral 1 like | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:22423] | 1.648 | 0.00025 | 0.00976 | |
DOWN | ||||
Hemoglobin subunit alpha 1 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:4823] | -3.312 | 0.00005 | 0.00295 | |
Calcium/Calmodulin dependent protein kinase Ⅱ beta | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:1461] | -2.189 | 0.00005 | 0.00295 | |
Coiled-coil domain containing 88B | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:26757] | -1.128 | 0.00005 | 0.00295 | |
Ripply transcriptional repressor 3 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:3047] | -1.039 | 0.00005 | 0.00295 | |
AlkB homolog 7 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:21306] | -1.027 | 0.00005 | 0.00295 | |
Transmembrane protein 256 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:28618] | -1.014 | 0.00005 | 0.00295 | |
Selenoprotein M | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:30397] | -1.01 | 0.00005 | 0.00295 | |
NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit A13 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:17194] | -1.007 | 0.00005 | 0.00295 | |
Hemoglobin subunit alpha 2 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:4824] | -6.617 | 0.00015 | 0.0068 | |
Claudin domain containing 2 | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:28511] | -1.392 | 0.00015 | 0.0068 | |
Troponin I2, fast skeletal type | ||||
[Source:HGNC Symbol;Acc:HGNC:11946] | -1.128 | 0.0002 | 0.00832 |
또한, 모든 DEG들에 대한 유전자 온톨로지(gene ontology, GO) 기능 분석을 진행한 결과, DEG에 풍부한 것으로 밝혀진 GO term은 biological process의 경우 'oxygen transport', 'gas transport', 'hydrogen peroxide catabolic process', 'antibiotic catabolic process', 'bicarbonate transport', 'response to inorganic substancé 및 'hydrogen peroxide metabolic process'가, cellular component의 경우에는 'haptoglobin-hemoglobin complex', 'hemoglobin complex', 'endocytic vesicle lumen' 및 'cytosolic small ribosomal subunit'이, molecular function의 경우에는 'haptoglobin binding', 'oxygen carrier activity', 'oxygen binding', 'molecular carrier activity', 'peroxidase activity' 및 'oxidoreductase activity, acting on peroxide as acceptor'로 확인되었다(Fig. 3). 하지만, 본 실험에서는 어떤 유전자들의 발현 변화가 세포증식의 억제를 유도하는지를 확인하는 것에 중점을 두었기 때문에 유의미한 차이를 나타내는 것으로 확인된 16개의 DEG들 중 발현이 증가되었을 시 세포증식을 활성 시키는 것으로 알려진 유전자(
TTX를 0 및 100 μM의 농도로 처리하여 qRT-PCR을 진행한 결과, Fig. 4와 5에 제시된 바와 같이 RNA-seq 결과와 유사하게
SW620 세포에 TTX를 처리하였을 시 세포증식이 억제된다는 선행 연구(Xiao, 2014)와 유사하게 본 실험에서도 MTT assay 결과 세포증식이 억제되는 것으로 확인되었다(Fig. 1). 하지만, 세포증식을 억제하는 메커니즘은 RNA-seq과 qRT-PCR 결과에서도 명확하게 나타나지 않았다. 다만, 이러한 결과가 나타난 이유는 본 실험에서 세포증식을 억제시키는 것으로 확인된
결론적으로, TTX의 처리는 인간 SW620 대장암 세포의 증식을 억제시키는 데 효과가 있으며, 이러한 세포증식의 억제는
따라서, TTX가 SW620 세포의 증식에 영향을 미치는 메커니즘을 정확하게 밝히기 위해서는 추후 보다 더 다양한 DEG 분석 및 mRNA와 단백질 수준에서의 발현 변화를 추가적인 실험들을 통해 확인하는 과정이 필요할 것으로 생각된다. 또한, 본 실험이 이를 밝히는 데 중요한 기초자료로써 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
This study was supported by National Research Foundation of Korea (Project number: 2017R1A2B2012125).
The authors declare that they have no conflict of interest.