
코로나 19시대에 마스크 착용은 의무사항이 된지 오래다. 마스크 착용이 일상이 되면서 구강관리에 큰 관심이 많아지고 있다. 특히, 구취로 인한 불쾌감을 경험하는 사례가 늘고 있으며, 마스크 상시 착용으로 구강 내 환경 개선에 대한 관심사가 높아지고 있다(Seo et al., 2021). 구취의 원인으로 혀 바닥의 백태, 구강 건조증, 청결하지 않은 구강 위생, 구강질환 등이 발생하게 된다. 마스크 속 구강 건강을 위한 제품 개발이 다양해지고 있다. 구강청결제로 알려진 리스테린의 경우 살리실산메틸, 멘톨, 티몰, 유칼립톨 등 에센셜오일이 주성분으로 제조되며 가그린, 테라브레스 등 세틸피리디늄염화물, 염화세틸피리디늄을 조성으로 한 구강청결제가 일반적으로 알려져 있다(Lee, 2017).
하지만, 이러한 성분들은 장기간 사용시 부작용을 일으켜 횟수나 사용자에 대한 제한이 따른다(Giannelli et al., 2008). 화학물질의 안전성에 대한 관심이 증가되면서 생체 내 저독성이며, 천연소재 기반의 제품을 선호하고 있다. 천연 항균 및 항산화제로 알려진 녹차(green tea)의 폴리페놀 성분은 항균, 바이러스 감염 억제 및 당뇨예방 효과 등의 다양한 생리활성을 나타낸다. 특히, 녹차추출물의 카테킨 성분은 충치균(
젤란검(gellan gum)은
본 실험에 사용한 상어부산물(shark byproduct, SBE)은 영천돔베기에서 구입하여 이물질 제거를 위해 3~4차례 세척한 후 물기를 최소한으로 하여 냉동실(-40℃)에 보관하고 실험재료로 사용하였다. 젤란검(Gellan gum, GG, Mw =1,000 KDa), 수산화나트륨(NaOH), 아세트산(acetic acid), pepsin 등 Sigma-Aldrich Chemical Co. (USA) 제품을 사용하였다. 녹차잎(green tea extract, GTE)은 (주)대한다업에서 구입하여 추출한 후 사용하였다. 그 밖의 시약은 정제 과정 없이 사용하였다.
상어부산물 유래 추출물은 어류 콜라겐 추출 시 사용되는 Kim 등 (2010)의 방법에 따라 수행하였다. 상어부산물을 수세하여 이물질을 제거하고 비콜라겐성 단백질 제거를 위해 알칼리 처리 공정을 진행하고, 효소가수분해를 통해 알칼리를 처리한 원료에서 콜라겐 추출을 진행하였다. 즉, 상어부산물에 알칼리 처리는 시료 200 g에 0.2 N NaOH 용액을 시료 대비 5배(v/w) 가한 다음 4℃에서 24시간 동안 비 콜라겐성 물질을 제거하고 2~3차례 수세하였다. 효소가수분해 공정은 수세한 시료에 10배량의 0.1%(w/v)pepsin을 함유하는 0.1 M acetic acid을 가하여 24시간 동안 37℃에서 교반하여 분해하였다. 분해된 용액을 여과한 후 85℃에서 20분 동안 가열하여 효소를 불활성화 시킨 다음 동결건조 하여 필름을 제조하는 시료로 사용하였다.
SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 상어부산물 추출물의 단백질 subunit의 조성을 관찰하였다(Laemmli, 1970). 7.5% polyacrylamide gels (running gel)을 slab 겔용 유리판에 충전하고, 그 상부에 5% polyacrylamide gels (stacking gel)을 충전하였다. 상온에서 2시간 동안 방치하여 고분자를 중합시킨 후, tracking dye와 동량의 시료를 혼합하였다. 100℃에서 5분간 반응시킨 다음 단백질량이 50 μg 되도록 조제한 시료를 겔 상부에 충전시키고 200 V, 80 mA의 조건에서 전기영동을 진행하였다. 전기영동이 끝난 후 Coomassie Blue R 250 용액으로 염색한 다음 탈색, 건조하여 단백질 밴드를 확인하였다.
녹차잎 30 g을 70% 에탄올 100 mL에 침지시켜 초음파 처리를 30분간 40 kHz로 진행하였다. 초음파 처리된 추출물은 여과하여 감압 농축하였다. 농축된 추출물은 동결건조 후 분말형태로 보관하여 실험에 사용하였다. 녹차추출물(GTE)의 성분 분석은 GC-MASS (GC-2010, Shimadzu Co., Japan)를 활용하였다. 추출물을 DMSO에 충분히 용해시킨 후, 원심분리기를 이용하여 부유물을 제거하고 상층액을 실린지 필터로 여과하여 시료를 준비하였다. 컬럼은 BD-5 (60 mm×0.25 mm×0.25 mm)를 사용하였고, 이동 가스 비율은 1 mL/min, 주입구 온도는 250℃, split ratio 10:1, 온도는 50~300℃/3℃ 승온으로 주입량은 1 μL 조건으로 분석을 하였다.
필름을 제조하기 위해 예비실험을 통해 SBE/GG 용액에 다양한 가소제(과당, 글리세롤, 자당 및 소르비톨)를 혼합하여 필름을 제조하였다. 선행연구를 통해 소르비톨을 선정하여 필름을 제조하였다. 필름형성용액은 SBE (2%)와 GG (2%)을 증류수 100 mL에서 80℃ 온도에서 교반하여 용해하고 상온에서 균질화 후, 15분 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리(degassing)로 혼합물의 기포를 제거시킨 후, 소르비톨 10 mg과 GTE을 50 mg과 100 mg의 농도로 각각 첨가하여 30분 동안 교반하였다. 최종 용액 25 mL씩을 테프론 코팅 플레이트에 캐스팅하고 상온에서 16시간 동안 건조시켰다. 건조 후 SBE/GG-GTE50, SBE/GG-GTE100 조성 막을 d-PBS로 가교 한 후, 3차 증류수로 2~3번 세척하여 필름을 제조하였다. 필름은 상온 상대습도 50% 조건의 챔버에 보관하여 실험에 시용하였다.
필름의 인장강도(tensile strenth, TS)와 신장률(elongation at break, E)은 ASTM Standard Method D882-91 방법(ASTM, 1993)에 따라 Instron Universal Testing Machine (Model 4484, Instron Co., USA)을 사용하여 측정하였다. 측정 전 필름은 상대습도 및 온도가 50%와 25℃로 조절되는 항온 항습기에서 48시간 저장하여 수분 함량을 조절한 다음, 2.5× 7 cm의 크기로 절단하여 한 시료 당 4번 반복 측정하였다.
수분함량(moisture content)의 경우 2×2 cm2 치수의 필름을 칭량하고 필름 시료를 105℃에서 24시간 건조하였다. 다음 식에 대입하여 수치화 하였다. W0은 시료 초기 건조 질량(g)이고, W1은 샘풀의 최종 건조 질량(g)이다. 모든 실험은 세 번 이상 수행하였다.
필름 용해도(water solubility, WS)는 ASTM (1983) 방법에 따라 시료 50 mg을 30 mL 증류수가 들어있는 원심분리용 튜브에 24시간 동안 담근다. 튜브를 9,000 rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 그 후, 105℃오븐에서 12시간 이후 무게를 측정한다, WS는 다음 식에 대입하여 수치화 하였다. W1은 필름의 초기 무게이며, W2는 용해되지 않은 건조된 무게이다.
추출물 함유 필름의 항균활성은 Lim 등 (2009)의 방법을 변형하여 측정하였다. 황색포도상 구균(
항산화능 측정을 위해 필름추출용액을 제조하였다. 필름 30 mg을 3 mL 증류슈에 완벽히 용해시켜 DPPH 저해능과 ABTS 라디컬 소거활성 실험에 사용하였다. DPPH 라디칼소거활성은 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)에 대한 전자공여 활성으로 나타내었다. 96 well plate에 각 추출물을 에탄올 70%에 희석한 용액 100 μL와 DPPH 용액(4×10-4 M in ethanol) 100 μL를 넣고 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader (EL 340 Biokinetics Reader, Bio-Tek Instrument, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 활성은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도 비(%)로 계산하였다.
ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 7 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt (ABTS) 용액과 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온의 암소에 16시간 보관한 후 734 nm에서 흡광도가 0.7가 되도록 증류수로 조정한 용액을 사용하였다. ABTS 용액에 동량의 시료액을 혼합하여 실온에서 1분간 반응시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼소거활성은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도 비(%)로 계산하였다.
상어부산물로부터 추출한 펩신 가용화 단백질의 subunit의 조성과 대조군으로 육상 유래 콜라겐인 bovine achilles tendon의 단백질 subunit의 조성은 Fig. 1과 같다. 대조군 콜라겐의 패턴의 경우 α1, α2의 밴드를 가지는 heterotype의 tropocollagen이었으며, β 밴드의 이동도가 관찰되었다.
펩신으로 가용화 시킨 상어부산물 추출물은 세 개의 밴드가 관찰되었다. α1-chain과 β-components 및 γ-components의 콜라겐 사슬이 관찰되었다. Bovine achilles tendon type I collagen의 pattern과는 다소 α1, α2의 이동도가 달랐으며, β-components를 가지고 있었다.
은어(Plecoglossus altivelis)의 뼈에서 추출한 collagen의 경우 분자 내외에 crosslinked components가 많아 각 α chain이 불명확하다고 보고하였다(Nagail and Suzuki, 2000). 또 고등어 껍질 collagen은 α1 chain 하나만을 가지는 homotype의 tropocollagen였다(Kimura et al., 1988).
Minke whale (
Fig. 2는 에탄올 70%로 추출한 녹차추출물의 GC-MASS로 성분 분석을 진행한 결과 카페인(caffeine) 성분이 다량 함유되어 있음을 확인하였다(Matsuzaki and Hara, 1985). 폴리페놀계에 속하는 Phenol, caffeine, decanoic acid의 성분이 확인되었다. 특히 caffeine acid 성분이 96%인 것을 확인하였다(Table 1). 커피에서 항균력을 갖는 성분에 대한 연구에서 카페인의 경우 사상균류(filamentous fungi)에 대하여 항균작용을 보이며 곰팡이가 만들어내는 아플라톡신(aflatoxin)의 생산을 억제한다(Buchanan and Fletcher, 1978). 대장균(
Chemical compositions of
Peak | Compound name | Formular | Real.Time (min) | Area (%) |
---|---|---|---|---|
1 | Tridecane | C13H28 | 17.7 | 0.75 |
2 | 2-Isopropyl-5-methyl-1-heptanol | C11H24O | 22.63 | 0.6 |
3 | Phenol | C6H6O | 30.85 | 0.3 |
4 | Propanoic acid | C3H6O2 | 34.03 | 0.83 |
5 | Caffeine | C8H10N4O2 | 42.84 | 96.9 |
6 | n-Decanoic acid | C10H20O2 | 47.14 | 0.62 |
SBE/GG 조성 필름의 인장강도를 측정한 결과, GTE의 추출물이 담지되었을 때, 더 높은 인장률을 확인하였다(Fig. 4). 이런 결과는 녹차추출물 내에 탄닌산(tannic acid)및 카페인산(caffeine acid)의 성분이 필름의 고분자 내의 화합물에 가교를 일으키는 것으로 사료된다(Natarajan et al., 2013). SBE/GG 필름은 6.01 MPa, SBE/GG-GTE 50 조성 필름은 9.029 MPa, SBE/GG-GTE 100 조성 필름은 10.569 MPa으로 관찰되었다. 옥피단백질 조성의 필름에서 녹차추출물이 0.5%일 때 9.01 MPa, 1.0%일 때 11.21 MPa, 1.5%일 때 5.15 MPa로 증가하다 감소하는 경향을 보였다. 일정 농도의 녹차추출물이 함유됨에 따라 필름의 인장강도 및 물성에 대한 변화는 본 연구와 동일한 연구 결과를 나타냈다(Yang et al., 2015).
항균 필름의 수분 함량 및 용해성 평가를 진행하였다(Fig. 3). GTE가 함유된 필름에서 수분 함유량이 대조군 필름보다 높은 것을 확인하였다. 이는 GTE에 존재하는 폴리페놀의 수산기가 수분과 결합하여 수분량을 증가시키는 것으로 사료된다(Nouri and Mohammadi, 2014). 용해도 측정 결과 GTE가 함유된 필름에서 더 높은 용해도를 관찰하였으며, 상어부산물 추출물인 단백질의 함량이 높을수록 용해도가 낮아지는 경향을 관찰하였다. 또한, GTE가 함유된 필름이 수상에서 용해되면서 용해도가 증가되는 것을 확인하였으며, 대조군에 비해 더 많은 수소결합을 하기 때문이라고 판단된다. 필름 조성 물질에서 상어부산물의 단백질의 비율이 높을수록 GTE와 수소결합 및 소수성 결합이 증가함에 따라 수분이 침투할 수 있는 부분이 줄어들어 용해도가 감소하는 경향을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과와 유사하게 옥피단백질 조성에 다양한 가교제를 첨가하여 물성을 평가한 연구에서 폴리페놀 성분의 함량이 증가됨에 따라 단백질 결합에 영향을 주어 인장강도 등을 향상시킨 결과와 유사함을 나타낸다(Yang et al., 2015).
치아관련 질환을 일으키는 균 중
GTE를 첨가한 SBE/GG 필름의
이는 GTE의 폴리페놀 성분이 미생물의 DNA, RNA 대사에 영향을 끼치며 세포분열을 방해하기 때문에 미생물의 생장이 억제된다고 판단된다(Kumudavally et al., 2008). Kim 등 (2006)의 연구에서 soy protein isolate 조성 필름에 GTE를 첨가하여 항균성을 평가한 결과, GTE 함량이 증가할수록
녹차에는 카페인 외에 카테킨, 탄닌, 크로로필, 비타민 C 등 다양한 유효 성분이 많이 함유되어 있으며, 카테킨류 중 에피가룰로카테킨 갈레이트의 함량이 높아 항산화력이 높다고 알려져 있다(Qusti et al., 2010). GTE를 첨가한 SBE/GG 조성 필름의 DPPH radical 소거능 결과, GTE가 50 mg 및 100 mg이 첨가된 필름 용액에서 각각 94±1.41, 98±1.24%의 항산화능을 관찰하였다. GTE 첨가 양이 증가할수록 DPPH radical 소거능도 증가하였다(Fig. 6). 이는 GTE에 존재하는 폴리페놀의 수산기가 DPPH radical과 반응되어 항산화능을 나타냈다(Choi et al., 2003).
또한, ABTS 양이온 소거 측정방법은 지용성 환원물질종류의 항산화제와 수소 공여 항산화제 모두를 측정할 수 있다. SBE/GG 조성 GTE가 50 mg 및 100 mg이 첨가된 필름 용액에서 각각 82.3±2.05, 97.3±1.69%의 항산화능을 관찰하였다. 친수성과 소수성 모두에 적용이 가능하기 때문에 DPPH 방법보다 더 민감하게 항산화 능력을 알아볼 수 있는 방법으로 알려져 있다.
Wang 등 (2013)의 연구에서도 키토산 조성 필름에 녹차추출물을 첨가하였을 때 이와 유사한 결과를 보였다. 이러한 결과는 식품 포장에 적용하였을 때 지방산화를 저해하여 저장성을 높일 수 있을 것으로 사료된다. Lee 등 (2015)의 연구에서도 카테킨(catechin)와 ECGC가 주요 성분인 녹차의 ABTS radical 소거능을 측정한 결과, 10 ppm의 경우 소거능이 약 80% 이상으로 항산화능이 있음을 보고한 바 있다. 비타민 E와 비교한 녹차추출물 IC50의 결과 녹차추출물은 29.3 μg/mL, 비타민E는 234.4 μg/mL로 비교적 높은 항산화능을 확인할 수 있었다(Yun et al., 2001).
따라서 본 연구 결과, GTE를 첨가한 SBE/GG 필름의 모든 물성과 항산화, 항균활성을 고려했을 때 GTE 100 mg를 첨가 시 구강 내 항균 기능을 향상 시킬 수 있는 필름 조건으로 판단된다. 이러한 필름은 식품, 의약품, 미용 산업에 활용 가능한 기능성 필름으로 다양한 산업화를 기대할 수 있다.
This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (Grant number: 2020Rll1A3072936).
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.