
식중독은 식품에 의해 체내에 병원체가 유입되어 증식하거나 생성된 독소를 섭취하였을 때 발생하기 때문에 감염성(infection) 또는 독소형(intoxication) 질환으로 분류된다(Kwun and Lee, 2007). 식품의약품안전처에서 주요 식중독 원인 미생물로 지정한
2020년 12월부터 2021년 9월까지 수도권에 소재한 4곳의 수산물도매시장에서 참굴(
시료 전 처리 과정은 식품의약품안전처 2021년 식중독 원인조사 시험법 가이드라인에 따라 진행하였다. 주요 식중독 원인 세균인
주요 식중독 원인 바이러스인 NoV, SV를 분리하기 위해 패류 중장선 3~6 g에 3 mL의 Proteinase K (Sigma-Aldrich, Missouri, USA)를 분주하고 Tissue Homogenizer를 사용하여 균질화 하였으며 Shaking Incubation에서 37℃, 25 g로 60분간 반응 후 Water Bath에서 60℃로 15분간 추가로 반응시켰다. 이후 4,000 g로 원심분리하여 상층액은 RNA 추출을 위한 시료로 사용하였다.
증균된 시료는 DNA Extraction Kit (Kogenebiotech, Seoul, Korea)에서 제공하는 방법에 따라 추출하였으며 시료 1 mL에 Lysis buffer A와 B를 각각 400 μL, 40 μL, Proteinase K와 RNase A를 10 μL씩 넣은 후 65℃로 60분간 항온수조에서 반응시킨 후 binding buffer 400 μL를 혼합하여 원심분리하였다. 상층액을 DNA binding column에 옮겨 14,328 g로 원심분리 후 washing buffer 600 μL로 세척하였다. 이후 elution buffer 100 μL를 넣고 3분 동안 6,368 g로 원심분리하여 DNA를 회수하였으며 Microvolume Spectrophotometer (PhileKorea, Seoul, Korea)로 순도와 수율을 측정 후 Multiplex PCR의 주형 핵산으로 사용하였다. 주요 식중독 원인 세균의 특이적 프라이머와 양성대조군은 Multiplex (8-plex) Pathogen Detection KIT (Kogene biotech, Seoul, Korea)에서 제공되는 혼합물을 사용하였다.
Multiplex PCR을 수행하기 위하여 Primer Mix 5 μL, 2X Premix 10 μL, 주형 핵산(total DNA 또는 양성대조군) 및 멸균증류수를 총 volume 20 μL로 반응하였다. 95℃에서 10분간 초기 변성단계 이후 95℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 결합, 72℃에서 30초간 신장의 단계를 35회 반복하였고 72℃에서 10분간 최종 신장하여 세균 종류별로 다른 Size의 특이적 유전자 단편을 증폭하였다. PCR 증폭산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동하여 결과를 분석하였다.
각 시료는 Universal RNA Extraction Kit (Bioneer Coporation, Daejeon, Korea)에서 제공하는 방법에 따라 추출하였으며 시료 500 μL에 RB buffer 500 μL를 넣어 혼합한 후 19,502 g로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 99% Ethanol 200 μL와 혼합하여 RNA를 침전하였으며 binding column으로 옮겨 원심분리 후 700 μL의 RWA1 buffer와 500 μL의 RWA2 buffer로 세척하였다. 이후 ER buffer 100 μL를 넣어 RNA를 회수하였으며 순도와 수율을 측정 후 RT/Nested PCR의 주형 핵산으로 사용하였다. NoV와 SV의 특이적 프라이머는 Table 1과 같이 제작하였으며, 양성대조군은 NoV GI (NCBI accession number JQ388274.1 기준 5,283~5,673), NoV GII (KX356908.1 기준 5,011~5,403) 및 SV (KP298674.1 기준 4,440~6,436)의 염기서열을 수집 후 (주)Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 핵산을 합성하였다.
RT/Nested PCR primer sets of
Virus | Target gene | Type | Name | Sequence (5'→3') | Polarity | Location | Size (bp) | Remark |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
NS7-VP1 | RT-PCR | SV-F13 | GAY YWG GCY CTC GCY ACC TAC | + | 5074~5094 | 803 | KP298674.1 | |
RT-PCR | SV-R13 | GGT GAN AYN CCA TTK TCC AT | - | 5857~5876 | ||||
Nested PCR | SV-F21 | ANT AGT GTT TGA RAT GGA GGG | + | 5157~5177 | 435 | |||
Nested PCR | SV-R2 | GWG GGR TCA ACM CCW GGT GG | - | 5572~5591 | ||||
VP1 | RT-PCR | GI-F1M | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GAT GAT | + | 5339~5362 | 330 | JQ388274.1 | |
RT-PCR | GI-R1M | CCA ACC CAR CCA TTR TAC ATY TG | - | 5646~5668 | ||||
Nested PCR | GI-F2-U | TGA TGG CGT CTA AGG ACG C |
+ | 5355~5377 | 314 | |||
Nested PCR | GI-R1M | CCA ACC CAR CCA TTR TAC ATY TG | - | 5646~5668 | ||||
NS7-VP1 | RT-PCR | GII-F1M | GGG AGG GCG ATC GCA ATC T | + | 5058~5076 | 341 | KX356908.1 | |
RT-PCR | GII-R1M | CCR CCI GCA TRI CCR TTR TAC AT | - | 5376~5398 | ||||
Nested PCR | GII-F3M | TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART | + | 5088~5111 | 311 | |||
Nested PCR | GII-R1M-U | GCC RCC IGC ART ICC RTT RTA CAT |
- | 5376~5398 |
1) Universal Primer (T7), AATACGACTCACTATAG (17 bp); 2) Universal Primer (M13R), GCGGATAACAATTTCACACAGG (22 bp)
RT PCR을 수행하기 위하여 AccuPower® RT-PCR PreMix (Bioneer Coporation, Daejeon, Korea), 25 pmol 농도의 정방향 · 역방향 프라이머 2 μL, 주형 핵산(total RNA 또는 양성대조군) 1 μL 및 멸균증류수 17 μL로 총 volume 20 μL로 반응하였다. 45℃에서 60분간 역전사, 94℃에서 5분간 초기 변성단계 이후, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 결합, 72℃에서 1분 30초 동안 신장단계를 35회 반복하였고 72℃에서 7분간 최종 신장하였다. Nested PCR을 수행하기 위하여 AccuPower® HotStart PreMix with UDG (Bioneer Coporation), 25 pmol 농도의 정방향 · 역방향 프라이머 2 μL, 주형 핵산(RT PCR 산물) 1 μL 및 멸균증류수 17 μL로 총 volume 20 μL로 반응하였다. 94℃에서 5분간 초기 변성단계 이후, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 결합, 72℃에서 1분 30초간 신장단계를 35회 반복하였고, 72℃에서 7분간 최종 신장하였다. PCR 증폭산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동하여 결과를 분석하였다.
전기영동 결과에서 단일 밴드가 확인된 시료의 경우 Total Fragment DNA Purification Kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)의 PCR purification Protocol에 따라 정제하였다. Nested PCR 산물을 5X BNL Buffer와 혼합 후 column으로 옮겨 11,000 g로 30초간 원심분리하였다. 750 μL의 washing Buffer (added EtOH)를 사용하여 세척 후 elution buffer를 첨가하여 DNA를 정제하였다. 멀티 밴드가 확인된 시료의 경우 gel extraction 방법에 따라 정제하였다. 염기서열 분석이 필요한 밴드 위치의 agarose gel을 UV 상에서 잘라내어 500 μL의 BNL buffer와 혼합한 후 항온수조에서 55℃에서 10분간 반응시켰다. 이후 column에 옮겨 11,000 g로 30초간 원심분리 후 washing buffer와 elution buffer를 사용하여 DNA를 정제하였다.
정제된 DNA는 (주)Macrogen (Seoul, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였으며, 유전형 분석을 위해 NoV GI.1~9 염기서열 28개, NoV GII.1~NA2 염기서열 36개와 대조군으로
식중독 원인 세균을 조사하기 위해 multiplex PCR을 수행하여 패류 종류별로 분석한 결과 Fig. 1과 같이 참굴, 홍합 및 가리비에서 각각 50개 중 7개(14%), 100개 중 12개(12%) 및 80개 중 2개(2.5%)에서
Seasonal difference of Foodborne Bacteria in Shellfish
Season | December ~ Februray | July ~ September | Total | ||||||||
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Sample | |||||||||||
Bacteria | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||
- | - | - | - | - | - | - | - | - | |||
7 (14) | - | - | - | - | 12 (12) | 2 (2.5) | - | 21 (6.7) | |||
- | - | - | - | - | - | - | - | - | |||
- | - | - | - | - | - | - | - | - | |||
- | - | - | - | - | 5 (5) | 8 (10) | - | 13 (4.1) | |||
- | - | - | - | - | - | - | - | - | |||
- | - | - | - | - | - | - | - | - | |||
Total | 7 (14) | - | - | - | - | 17 (17) | 10 (12.5) | - | 34 (10.9) |
식중독 원인 바이러스 조사를 위해 RT/Nested PCR을 수행하여 패류 종류별로 분석한 결과 모든 패류에서 SV는 검출되지 않았으며, 참굴 102개 중 7개(6.8%)에서 NoV GI, 12개(11.7%)에서 NoV GII가 검출되었다. 원산지별로 분석한 결과 참굴 102개 중 통영이 원산지인 1개(0.9%) 시료에서 NoV GI이 검출되었으며, 고흥이 원산지인 1개(0.9%) 시료에서 NoV GII가 검출되었다. 또한 참굴 102개 중 여수가 원산지인 3개(2.9%)의 시료에서 NoV GI이 검출되었으며, 9개(8.8%) 시료에서 NoV GII가 검출되었다. 참굴 102개 중 인천이 원산지인 경우 3개(2.9%) 시료에서 NoV GI이 검출되었으며, 2개(1.9%) 시료에서 NoV GII가 검출되었다. 계절별로 분석한 결과 Table 3, Fig. 2와 같이 12월~2월(겨울~봄)에는 102개 중 7개(6.8%)의 참굴에서 NoV GI이 검출되었으며, 12개(11.7%)의 참굴에서 NoV GII가 검출되었다. 7월~9월(여름~가을)에는 SV 및 NoV GI, GII가 검출되지 않았다.
Seasonal difference of
Season | December ~ February | July ~ September | Total | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Sample | |||||||||||
Virus | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||
7 (6.8) | - | - | - | - | - | - | - | 7 (6.8) | |||
12 (11.7) | - | - | - | - | - | - | - | 12 (11.7) | |||
Total | 19 (18.6) | - | - | - | - | - | - | - | - |
분석된 NoV 염기서열에 대한 NCBI BLAST 결과 Sample #1~2는 NoV GI.3와 99.19%, 98.58%, Sample #3은 NoV GI.5와 100%, Sample #4는 NoV GII와 98.99%의 유사성이 확인되었다. RIVM
본 연구에서는 국내에서 다양한 식자재로 활용되며 주로 생식으로 많은 섭취가 이루어지는 여러 종류의 패류에 대한 미생물학적 안전성을 확인하고자 식중독 원인 미생물의 분포를 비교분석을 하였으며 특히 폭발적으로 식중독을 유발하는 바이러스의 분포 및 유전형을 분석하고자 하였다. 연구 결과,
None.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.