면역반응은 외부에서 유입되는 박테리아, 바이러스와 같은 다양한 감염원으로부터 신체를 보호하기 위한 방어작용이다(Basha et al., 2014). 최근, 면역 조절 장애 질환이 증가하는 추세로 특히 감염, 스트레스, 노화 등으로 인한 면역시스템 이상은 암, 전염병, 알레르기, 천식 및 관절염과 같은 면역관련 질환을 유발시키는 것으로 보고되고 있다(Kumar and Bhat, 2016). 면역 체계는 선천적 면역과 후천적 면역이 유기적인 상호작용으로 조절된다. 선천적 면역은 감염 초기에 광범위한 병원체에 대한 비특이적으로 일어나며, 후천적 면역은 활성화된 T 림프구, B 림프구가 감염에 대해 특이적으로 일어나는 것으로 특정 감염원에 대한 기억반응이 유도되어 질병을 예방할 수 있다(Nathaniel et al., 2020). B 림프구는 항원과 결합하는 항체를 생성하면서 면역기능을 유도하고 T 림프구는 다양한 사이토카인을 분비함으로써 면역반응을 조절한다(Delves and Roitt, 2000; Hoffman et al., 2016). 면역반응 조절에서 인터루킨(IL)-2은 T 림프구 분화를 조절하고, 인터페론(INF)-γ는 대식세포를 포함한 면역세포 활성화에 관여한다. 특히 IL-2와 IFN-γ 결핍은 다양한 병원체 대한 감염이 더 쉽게 발생된다고 보고되어 있다(Dalton et al., 1993). 따라서 사이토카인 활성을 조절하는 천연물은 면역증강 기능성 소재로서 활용가능성이 있을 것으로 사료된다.

Cyclophosphamide (CP)는 DNA 알킬레이션 유도제로 백혈병, 난소암 및 유방암 등 다양한 종양의 치료를 위해 사용되고 있다(Huitema et al., 2000). 암환자들에게 광범위하게 사용되는 치료제임에 불구하고 CP 투여는 체중 감소, 혈소판 감소증 및 림프구 감소를 통한 면역억제 등 심각한 부작용이 보고되고 있다(De Souza et al., 2000). 따라서 항암 치료제로 인한 체내면역 기능 저하를 완화시킬 수 있는 면역조절 기능성 소재 발굴 연구가 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

참당귀(Angelica gigas Nakai, AGN)는 미나리과(Umbelliferae)에 속하는 다년생 초본으로 약성이 따뜻하고, 무독하여 다양한 질환에 약용식물로 활용되고 있다. 특히, 참당귀는 당뇨 개선 효과, 혈소판 응집억제 작용, 항산화 효능 간질환 개선 및 항암작용 등이 보고되고 있다(Kim et al., 2004; Lee et al., 2009; Park et al., 2007). 참당귀의 대표적인 유효성분으로는 decursin, nodakentin, limonene, β-sitosterol 및 umbelliferon 등이 알려져 있다(Kim et al., 2009). 최근 면역기능에 대한 중요성이 대두되면서 면역기능을 조절할 수 있는 기능성 소재 개발 연구가 활발히 진행되고 있으나 효능 및 안전성 입증을 위한 과학적 근거가 부족한 실정이다. 본 연구에서는 면역증강 기능성 소재를 개발하기 위해 CP로 유도된 면역저하 동물모델에서 참당귀 추출물의 면역력 증강 활성을 평가하였다.

실험동물

본 실험에서는 6주령의 웅성 ICR mice를 효창(Daegu, Korea)에서 공급받아 약 7일간 적응시킨 후 자유식이와 물을 충분히 공급해주면서 사육하였다. 사육실의 온도는 22±2℃로 유지되었고, 습도는 50±5%로 하였으며, 조명은 12시간 주기로 사용하였다. 본 동물실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원회 규정에 따라 진행하였다.

실험재료

CP, Eosin, hematoxylin 및 그 외 모든 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 마우스 IL-2, IFN-γ 및 TNF-α ELISA kit는 BD Biosciences (San Diego, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Tissue Protein Extraction Reagent은 Intron Biotechnology (Seongnam, Korea)에서 bicinchoninic acid (BCA) assay kit는 Pierce Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다. 참당귀 추출물은 (주)뉴트라젠(Eumseong, Korea)에서 제공받아 사용하였다.

면역저하 모델 및 시료 투여

마우스의 면역저하를 유도하기 위하여 시료 투여 시작 1일 및 3일 전에 125 mg/kg의 CP를 2회 복강에 주사하였고 정상군에는 CP 대신 증류수를 복강 투여하였다. 면역저하 유도가 종료된 후, 참당귀 추출물을 1일 1회, 14일 동안 경구투여 하였다. 총 실험군은 면역억제를 유도하지 않은 정상군(control), 면역억제 후 증류수 투여군(CP), 면역억제 후 참당귀 추출물 10 mg/kg 투여한 실험군(AGN10)과 100 mg/kg으로 투여한 실험군(AGN100)으로 총 4그룹이며 군당 7마리씩 실험에 사용하였다.

체중 측정

모든 실험동물의 체중은 CP 투여로 면역저하 유도 이후 증류수와 참당귀 추출물을 각각 투여하는 동안 일정시간에 모든 실험군의 개체별 체중을 측정하였다.

장기 무게 측정

최종 희생일에 모든 실험군의 개체별 비장 및 흉선을 적출하여 그 중량을 전자저울을 이용하여 g 단위로 각각 측정하였다.

혈액 분석

혈액은 EDTA tube에 담아 Roll mixer에 약 30분 회전시킨 후 혈액분석기를 이용하여 백혈구(white blood cell), 림프구(lymphocyte) 및 호중구(neutrophill) 등 혈액학적 검사를 진행하였다.

비장 내 cytokine 분석

최종 희생일에 비장 조직의 일부를 채취하여 세척 후 Tissue Protein Extraction Reagent의 lysis buffer를 사용하여 비장 조직을 균질화 하였다. 균질화된 비장 조직은 -4℃, 10,000 g의 조건하에서 5분 동안 원심분리를 실시하여 단백질이 포함된 상층액을 취하였다. BCA 시약으로 단백질 정량 후 ELISA kit를 활용하여 IL-2, IFN-γ 및 TNF-α의 수치를 측정하였다.

조직학적 분석

적출한 비장 조직은 10% formalin에 고정시킨 후 탈수 및 파라핀에 포매하여 4 μm의 두께로 절편을 제작하였다. Hematoxylin-eosin (H&E)로 염색된 조직은 광학현미경인 LEICA DMi8 (LEICA, Germany)를 이용하여 관찰하였다.

통계분석

실험 결과는 최소 3번 반복 실험하였고 통계프로그램 Graph Pad Prism software 5.0를 이용하여 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation, S.D.)로 나타내었다. 각 데이터의 통계분석은 ANOVA와 Bonferroni's post-hoc test에 의해 검정하였고, P<0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

면역저하 모델에서 체중 변화에 대한 참당귀 추출물의 영향

CP의 투여로 면역저하가 유도되면 부작용으로 체중 감소가 보고되어 있다. 본 연구에서는 CP로 유도된 면역저하 모델에서 체중 감소에 대한 참당귀 추출물의 영향을 측정하였다. 실험군의 체중 변화를 관찰한 결과, CP군에서는 정상군과 비교해서 체중 변화가 감소하였고, 참당귀 추출물 투여군에서는 CP로 유도된 체중 감소가 완화되는 것을 확인하였다. 실험 종료 후, 각 실험군 체중은 정상군의 경우 23.5±0.8 g, CP군 21.8±0.9 g로 CP 투여로 체중이 유의하게 감소된 것으로 확인되었다. 반면 CP 단독군과 비교하여 참당귀 추출물 10 mg/kg 투여군의 체중은 22.2±2.1 g, 참당귀 추출물 100 mg/kg 투여한 실험군은 22.8±1.6 g으로 CP로 인한 체중 감소가 완화되는 것으로 확인되었다(Fig. 1A). 각 실험군의 증체량을 측정한 결과, 참당귀 추출물군은 CP로 유도된 면역저하로 감소된 체중이 회복되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B).

Fig. 1. Effects of AGN on body weight in cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice. (A) Body weight detected during oral treatment with AGN 10 mg/kg and 100 mg/kg for 14 days. (B) Body weight gain after test (Body weight at sacrifice-Body weight at start). Data were represented in the mean ± S.D. and results were analyzed by Tukey post hoc test (#P < 0.05 versus control, *P < 0.05 versus CP alone).

면역저하 모델에서 장기 무게 변화에 대한 참당귀 추출물의 영향

CP 투여는 세포 독성으로 인해 비장과 흉선의 무게가 감소된다고 보고되어 있다. 본 연구에서는 CP로 유도된 면역저하 모델에서 장기 무게 변화에 대한 참당귀 추출물의 영향을 측정하였다. 실험 결과, CP군에서는 비장의 중량(0.077±0.02 g)이 정상대조군(0.139±0.018 g)에 비해서 유의하게 감소하는 것으로 확인되었다. 반면 참당귀 추출물을 투여한 실험군의 비장의 중량은 이 CP로 유도된 비장 무게 감소가 증가된 것으로 확인되었다. 특히 고농도 참당귀(100 mg/kg) 투여군의 비장의 무게는 0.12±0.021 g으로 CP군(0.077±0.02 g)보다 유의하게 증가된 것으로 확인되었다(Fig. 2A). 흉선의 중량 변화를 관찰했을 때, CP군의 중량은 0.045±0.004 g로, 정상군의 중량(0.0746±0.006 g)에 비해서 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다. 또한 고농도의 참당귀 추출물(100 mg/kg) 투여군에서 흉선의 중량(0.058±0.004 g)이 CP군보다 유의하게 증가된 것으로 확인되었다(Fig. 2B).

Fig. 2. Effects of AGN on organ weight in cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice. Spleen (A) and thymus (B) weight after oral treatment with AGN 10 mg/kg and 100 mg/kg for 14 days. Data were represented in the mean ± S.D. and results were analyzed by Tukey post hoc test (#P < 0.05 versus control, *P < 0.05 versus CP alone).

면역저하 모델에서 혈구세포에 미치는 참당귀 추출물의 효과

CP 투여는 혈구세포 감소로 면역저하를 유도하는 것으로 보고되어 있다(Son et al., 2003). CP로 유도된 면역저하 모델에서 참당귀 추출물의 혈액세포 변화에 미치는 영향을 분석하였다. 참당귀 추출물을 14일간 경구 투여한 후 혈액의 백혈구 수를 측정한 결과, CP 투여군의 백혈구 수는 정상군에 비해 감소되었고, 참당귀 추출물 투여군에서는 CP에 의해 유도된 백혈구 수치저하를 완화시키는 효과를 확인하였다(Fig. 3). 백혈구의 구성요소인 림프구 및 호중구의 경우, CP에 의해 혈액 내 비율이 변화되는 것을 확인할 수 있었다. 정상군과 비교 시 림프구 및 호중구는 비율이 유의미하게 감소하였으나(P<0.05), 참당귀 추출물 투여군의 경우 CP 투여로 유도된 감소 현상이 회복되는 것을 확인하였다. 특히 고농도 참당귀 추출물(100 mg/kg) 투여군에서 CP에 의해 저하된 림프구 및 호중구는 비율이 유의성 있게 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Effects of AGN on blood components in cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice. At the end of the experiment, blood cell count test was conducted by blood analyzer. Changes in white blood cell, lymphocytes and neutrophil. Data were represented in the mean ± S.D. and results were analyzed by Tukey post hoc test (#P < 0.05 versus control, *P < 0.05 versus CP alone).

면역저하 모델에서 비장기능 변화에 대한 참당귀 추출물의 영향

CP로 유도된 면역저하 모델에서 참당귀 추출물이 비장의 기능 변화에 미치는 영향을 측정하기 위하여 각 실험군의 비장 조직 병변을 관찰하였다. 정상군의 비장 조직은 림프소절(lymph nodule, LN)이 가장자리 구역(marginal zone, MZ)에 둘러싸여 있고 적색수질(red pule, RP)과 경계가 명확하게 구분된 것으로 관찰되었다. CP 투여군의 경우, 림프소절 가장자리 구역의 경계가 명확하지 않고 적색수질에서 응축된 세포들이 관찰되고 그 배열 또한 매우 불규칙한 것으로 나타났다. 반면 참당귀 추출물 투여군에서는 CP로 손상된 림프소절의 가장자리 구역이 회복되고 적색수질의 세포 응축 현상이 호전되는 것을 확인하였다(Fig. 4).

Fig. 4. Effects of AGN on histological feature of spleen in cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice. Spleens were stained with H&E reagent and ob-served by optical microscope. (A) Control; (B) CP; (C) CP+AGN 10 mg/kg; (D) CP+AGN 100 mg/kg. Original magnifi-cation: ×100. scale bar = 100 μm.

비장 조직 내 사이토카인 변화에 대한 참당귀 추출물의 영향

CP 투여로 유도된 면역저하 모델에서 참당귀 추출물이 비장 내 사이토카인 변화에 미치는 영향 측정하였다. IL-2, IFN-γ 및 TNF-α 발현에 대한 참당귀 추출물의 효과를 측정하기 위하여 각 실험군의 비장 조직에서 단백질을 추출 및 정량 후 ELISA 실험법으로 측정하였다. IL-2의 경우, CP 투여군은 0.46±0.08 pg/mL로 정상군(1.02±0.09 pg/mL)과 비교했을 때 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다(P<0.05). 참당귀 추출물 투여군(100 mg/kg)의 IL-2 수치는 0.62±0.09 pg/mL로 CP로 감소된 IL-2 발현양이 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다. IFN-γ의 경우, CP 투여군에서 1.80±0.18 pg/mL로 정상군(3.22±0.20 pg/mL)보다 유의성 있게 감소하였고(P<0.05), 참당귀 추출물(100 mg/kg) 투여군에서는 2.71±0.21 pg/mL로 CP 투여(1.80±0.18 pg/mL)로 감소된 IFN-γ 수준이 유의성 있게 증가되는 것을 확인하였다. TNF-α의 경우, CP 투여군은 2.51±0.28 pg/mL로 정상군(2.87±0.19 pg/mL) 보다 수치는 감소했지만 유의성은 없었다. 참당귀 추출물 투여군(100 mg/kg)의 TNF-α 수치는 2.65±0.35 pg/mL로 CP 투여군(2.51±0.28 pg/mL)과 비교 시 유의한 차이를 나타내지 않았다(Fig. 5).

Fig. 5. Effects of AGN on cytokines in cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice. At the end of the experiment, the spleen tissues were excised and homogenized. Following protein quantification, the levels of IL-2, IFN-γ and TNF-α in spleen tissue were assayed using ELISA assay kits. Data were represented in the mean ± S.D. and results were analyzed by Tukey post hoc test (#P < 0.05 versus control, *P < 0.05 versus CP alone).

면역계는 외부에서 유입되는 다양한 감염원으로부터 체내를 보호하는 방어시스템으로 면역기능이 저하된 상태에서는 면역반응의 불균형으로 암, 전염병, 알레르기 등의 다양한 질병이 유발된다. 따라서 건강한 인체를 유지하기 위해 면역력 증진을 위한 다양한 기능성 소재 발굴 연구의 필요성이 지속적으로 요구되고 있다. 본 연구는 CP로 유도된 면역저하 모델에서 참당귀 추출물의 면역조절 기능에 대한 효능을 평가하였다. 실험 결과, 참당귀 추출물의 투여는 CP로 손상된 면역기능을 활성화하여 감소된 체중 및 비장, 흉선의 조직중량, 혈구세포 구성, 혈액 내 면역관련 사이토카인 함량 등 전반적으로 면역기능이 회복되는 것으로 확인하였다. 이런 결과는 참당귀 추출물이 면역증진을 위한 기능성 소재로서의 활용가능성을 확인할 수 있었다.

CP는 백혈병, 난소암 및 유방암 등 다양한 종양 치료제로 사용되고 있으며 그 부작용으로 체중 감소 및 면역기관의 기능 장애 등이 보고되고 있다(Gladstone et al., 2002). 본 연구에서도 CP 투여군은 정상군에 비해 유의성 있는 체중 감소를 확인하였고, 반면 참당귀 추출물 투여군에서는 CP로 감소된 체중 변화가 회복되는 것을 확인하였다(Fig. 1). 또한 CP로 체내 면역저하를 유도하게 되면, 면역기관인 비장 및 흉선의 중량이 감소된다는 것이 보고된 바가 있다. CP 투여 면역저하 군과 참당귀 추출물 투여군에서 비장, 흉선의 중량을 측정한 결과, CP로 감소된 비장과 흉성의 중량이 참당귀 투여군에서 유의적으로 증가하였다. CP에 의해 유도되는 면역저하는 혈액 조성의 변화를 일으키며 적혈구, 백혈구 물론 림프구와 호중구 감소를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 연구 결과, CP 투여 면역저하 군에서 혈중 백혈구 수, 림프구 및 호중구의 비율이 정상군에 비해 현저한 감소가 확인되었으며, 참당귀 추출물 투여군에서는 CP에 의해 유도되는 혈액학적 저해작용이 완화되는 것을 확인하였다(Fig. 3).

참당귀 추출물 투여가 CP로 유도된 면역기관의 기능 저하에 대한 영향을 측정하기 위하여 비장 조직의 형태적인 변화를 관찰하였다. 조직병리학적 분석 결과, 정상군의 비장 조직은 림프소절이 가장자리 구역에 둘러싸여 있고 적색수질과 경계가 명확하게 구분된 것으로 관찰되었다. CP군의 경우, 림프소절 가장자리 구역의 경계가 명확하지 않고 적색수질에서 응축된 세포들이 관찰되고 그 배열 또한 매우 불규칙한 것으로 나타났다. 반면 참당귀 추출물 투여군에서는 조직 내 가장자리 구역이 선명하게 관찰되고 적색수질의 세포 응축 현상이 호전되는 것을 확인하였다(Fig. 4).

면역세포에서 분비되는 사이토카인은 다양한 면역기능을 조절하는 것으로 보고되어 있다(Jiang et al., 2010). 특히 TNF-α는 면역세포인 T 림프구의 분화를 유도하고, IL-2는 T cell 분화 및 세포성 면역을 활성화 시키며 Th1 세포에서 생성되는 IFN-γ는 대식세포의 기능을 강화하는 것으로 알려져 있다. CP의 면역저하 유도는 면역세포에서 사이토카인의 생성을 억제시키는 것으로 보고된 바 있다(Logani et al., 2012). 본 연구에서는 CP 투여로 유도된 면역저하 모델에서 참당귀 추출물이 비장 내 사이토카인 발현 변화에 미치는 영향을 ELISA 분석법을 이용하여 측정하였다. 실험 결과, CP 투여군에서는 비장 조직 내 IL-2와 IFN-γ 발현량이 유의성 있게 감소되었고, 참당귀 추출물 투여군에서는 저하된 IL-2와 IFN-γ 발현량이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 비장 조직 내 TNF-α 발현 변화에 대한 참당귀 추출물의 효과는 CP 투여군과 비교 시 유의한 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 참당귀 추출물은 면역기능 및 조혈작용 개선 효과가 있음을 증명하는 과학적 근거가 될 수 있을 것으로 사료된다.

결론적으로 본 연구는 CP로 유도된 면역저하 모델에서 참당귀 추출물의 면역조절 기능에 대한 효능을 평가한 결과로 참당귀 추출물의 면역기능 개선 효능을 과학적으로 입증하였다. 특히 참당귀 추출물의 경우 CP 투여로 유도된 체중 감소, 면역기관(비장 및 흉선)의 중량 변화 및 혈구세포의 감소가 개선됨을 확인하였다. 또한 CP로 유도된 비장 조직의 손상 및 사이토카인 발현량 감소가 참당귀 추출물에 의해 회복되는 것으로 확인하였다. 따라서 참당귀 추출물은 CP 투여로 유도된 면역저하 모델에서 면역증진 활성이 입증되었고 추후 면역조절 제품 개발에 기능성 소재로 활용 가능할 것으로 사료된다.

None.

The authors declare that they have no conflict of interest.