
해외의 경우 요로병원성 대장균의 O 혈청형과 병원성인자 및 계통분류군의 연관성에 대한 연구가 활발히 수행되고 있으나(Blanco et al., 1996; Clermont et al., 2000; Ananias and Yano, 2008; Baldy-Chudzik et al., 2008; Bukh et al., 2009), 국내에서는 요로병원성 대장균의 O 혈청형에 따른 병원성인자 및 계통분류군에 대한 연구를 찾아보기 힘들다.
따라서 본 연구에서는 1989년도와 2010년도부터 2014년도에 분리된 요로병원성 대장균을 대상으로 O-serogroup과 병원성인자 및 계통분류군을 분자생물학적 방법을 이용하여 비교 분석함으로써 국내에서 분리되는 요로병원성 대장균의 O-serogroup에 따른 병원성인자 보유율 및 계통분류군에 대한 역학적 기초자료를 제시하고자 하였다.
본 연구에서는 강원도 소재의 한 대학병원에서 1989년 3월부터 12월까지 수집한 요로병원성 대장균 123주와 2010년 7월부터 2014년 7월까지 수집한 요로병원성 대장균 558주를 본 연구에 사용하였다.
요로병원성 대장균을 brain heart infusion broth에 접종하여 37℃에서 18시간 배양 후, 세균 배양액 1 mL을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 수세하는 과정을 2회 반복하였다. 세균침사에 200 μL의 멸균증류수를 넣어 세균부유액을 제조하였고, 100℃에서 10분간 끓인 다음, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 주형 DNA로 사용하였다.
요로병원성 대장균의 O-serogroup를 확인하기 위한 multiplex PCR에 사용한 primer는 CosmoGenetech Co. (Seoul, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며 primer의 염기서열과 증폭된 산물의 크기는 Table 1과 같다(Li et al., 2010). 30 μL의 reaction mixture에는 추출한 대장균의 DNA 2 μL, 각 농도별 primer (Table 1), 10 X PCR buffer, 0.3 mM deoxynucleoside triphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 2 U의 G-
Oligonucleotide sequences for O-serotyping of UPEC
Serogroup | Primer | Primer sequence (5'-3') | Amplicon size (bp) | Target gene | Conc. in multiplex PCR (μM) | Reference |
---|---|---|---|---|---|---|
Group 1 | Li et al., 2010 | |||||
O1 | wl-14632-(F) | GTGAGCAAAAGTGAAATAAGGAACG | 1,098 | 0.05 | ||
wl-14633-(R) | CGCTGATACGAATACCATCCTAC | |||||
O6 | wl-14646-(F) | GGATGACGATGTGATTTTGGCTAAC | 783 | 0.07 | ||
wl-14647-(R) | TCTGGGTTTGCTGTGTATGAGGC | |||||
O7 | wl-14648-(F) | CTATCAAAATACCTCTGCTGGAATC | 610 | 0.12 | ||
wl-14649-(R) | TGGCTTCGAGATTAAACCTATTCCT | |||||
O8 | wl-14652-(F) | CCAGAGGCATAATCAGAAATAACAG | 448 | 0.12 | ||
wl-14653-(R) | GCAGAGTTAGTCAACAAAAGGTCAG | |||||
O16 | wl-14654-(F) | GGTTTCAATCTCACAGCAACTCAG | 302 | 0.13 | ||
wl-14655-(R) | GTTAGAGGGATAATAGCCAAGCGG | |||||
O21 | wl-14676-(F) | CTGCTGATGTCGCTATTATTGCTG | 209 | 0.12 | ||
wl-14677-(R) | TGAAAAAAAGGGAAACAGAAGAGCC | |||||
O75 | wl-17413-(F) | GAGATATACATGGGGAGGTAGGCT | 511 | 0.07 | ||
wl-17414-(R) | ACCCGATAATCATATTCTTCCCAAC | |||||
Group 2 | ||||||
O2 | wl-14636-(F) | AGTGAGTTACTTTTTAGCGATGGAC | 770 | 0.07 | ||
wl-14637-(R) | AGTTTAGTATGCCCCTGACTTTGAA | |||||
O4 | wl-14642-(F) | TTGTTGCGATAATGTGCATGTTCC | 664 | 0.07 | ||
wl-14643-(R) | AATAATTTGCTATACCCACACCCTC | |||||
O15 | wl-14672-(F) | TCTTGTTAGAGTCATTGGTGTATCG | 183 | 0.08 | ||
wl-14673-(R) | ATAAAACGAGCAAGCACCACACC | |||||
O18 | wl-14656-(F) | GTTCGGTGGTTGGATTACAGTTAG | 551 | 0.08 | ||
wl-14657-(R) | CTACTATCATCCTCACTGACCACG | |||||
O22 | wl-14660-(F) | TTCATTGTCGCCACTACTTTCCG | 468 | 0.08 | ||
wl-14661-(R) | GAAACAGCCCATGACATTACTACG | |||||
O25 | wl-14666-(F) | AGAGATCCGTCTTTTATTTGTTCGC | 230 | 0.08 | ||
wl-14667-(R) | GTTCTGGATACCTAACGCAATACCC | |||||
O83 | wl-14668-(F) | GTACACCAGGCAAACCTCGAAAG | 362 | 0.08 | ||
wl-14669-(R) | TTCTGTAAGCTAATGAATAGGCACC |
실험에 사용한 primer는 CosmoGenetech Co. (Seoul, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며 primer의 염기서열 및 증폭된 산물의 크기는 Table 2와 같다(Adamus-Bialek et al, 2009). Multiplex PCR을 이용하여 병원성인자를 검출하기 위해 30 μL의 reaction mixture에는 추출한 대장균의 DNA 2 μL, 5 pmole의 각 primer, 10 X PCR buffer, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphate, 1 U G-
Oligonucleotide sequences for amplification of the virulence factors genes and phylogenetic groups
Primer | Primer sequence (5'-3') | Amplicon size (bp) | Target gene | Reference | |
---|---|---|---|---|---|
VFs | pap1 | GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG | 328 | Adamus-Bialek et al., 2009 | |
pap2 | ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA | ||||
sfa1 | CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC | 410 | |||
sfa2 | CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA | ||||
cnf1a | AAGATGGAGTTTCCTATGCAGGAG | 498 | |||
cnf12a | CATTCAGAGTCCTGCCCTCATTATT | ||||
usp1mod | TTCTGGGGAACTGACATTCACGG | 657 | |||
usp2mod | CCTCAGGGACATAGGGGGAA | ||||
fimGH1 | GCAATGTTGGCGTTCGCAAGTGC | 1,001 | |||
fimGH2 | CGTAAATATTCCACACAAACTGG | ||||
hly1mod | AACAACGATAAGCACTGTTCTGGCT | 1,177 | |||
hly2mod | ACCATATAAGCGGTCATTCCCATCA | ||||
PGs | TspE4C1 | GAGTAATGTCGGGGCATTCA | 152 | TSPE4.C2 | Clermont et al., 2000 |
TspE4C2 | CGCGCCAACAAAGTATTACG | ||||
YjA1 | TGAAGTGTCAGGAGACGCTG | 211 | |||
YjA2 | ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC | ||||
ChuA1 | GACGAACCAACGGTCAGGAT | 279 | |||
ChuA2 | TGCCGCCAGTACCAAAGACA |
Abbreviation: VFs, virulence factor; PG, phylogenetic group
계통분류군을 확인하기 위해 실험에 사용한 primer의 염기서열은 Table 2와 같다(Clermont et al., 2000). 20 μL의 reaction mixture에는 추출한 요로병원성 대장균의 DNA 2 μL, 10 pmole의 각 primer, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphate, 2.5 U G-
1989년도와 2010-2014년도에 분리한 요로병원성 대장균의 O-serogroup의 분포는 Table 5와 같다. 요로병원성 대장균의 O-serogroup을 확인하기 위한 multiplex PCR 방법으로 O-serogroup가 검출되지 않은 경우가 1989년도 분리주에서 123주 중 55주(44.7%), 2010-2014년도 분리주에서 558주 중 136주 (24.4%)였고, 이를 제외하면 1989년도 분리주에서 68주 (55.3%), 2010-2014년도 분리주에서 422주 (75.6%)에서 O1, O2, O4, O6, O7, O8, O15, O16, O18, O21, O22, O75 및 O83에 해당하는 O-serogroup을 확인할 수 있었다. 1989년도 분리주에서는 O15, O16, O18 및 O22는 확인되지 않았으며, O6 (11.1%), O25와 O75 (9.8%), O8 (7.1%), O1 (4.8%), O21 (3.2%), O2와 O4 (2.4%), 07 (0.8%)의 빈도로 나타난 반면, 2010-2014년도 분리주에서는 O25 (21.0%), O2 (12.4%), O75 (10.8%), O6 (7.7%), O1 (7.2%), O8 (3.6%), O15 (3.4%), O18 (2.7%), O16 (2.5%), O4 (1.6%), O22와 O7 (0.9%), O21와 O83 (0.5%)로 확인되었다.
O-serogroup, virulence factors and phylogenetic group of uropathogenic
O-serogroup | Year | Virulence factors | Phylogenetic group | ||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
A | B1 | B2 | D | Total | |||||||||
O1 | 1989 | 6 (100%) | 2 (33.3%) | 2 (33.3%) | 5 (83.3%) | - | - | - | - | - | 6 | 6 (4.9%) | |
2010-2014 | 36 (90%) | 4 (10%) | 12 (57.5%) | 3 (7.5%) | 8 (20%) | 4 (10%) | - | - | 20 | 20 | 40 (7.2%) | ||
O2 | 1989 | 3 (100%) | 3 (100%) | 1 (33.3%) | 2 (66.7%) | 3 (100%) | 2 (66.7%) | - | - | 3 | - | 3 (2.4%) | |
2010-2014 | 68 (98.6%) | 19 (27.5%) | 63 (91.3%) | 8 (11.6%) | 24 (34.8%) | 3 (4.3%) | - | - | 65 | 4 | 69 (12.4%) | ||
O4 | 1989 | 2 (100%) | 2 (100%) | 2 (100%) | 2 (100%) | 2 (100%) | 1 (57.1%) | 1 | - | 2 | - | 3 (2.4%) | |
2010-2014 | 9 (100%) | 5 (55.6%) | 4 (44.4%) | 4 (44.4%) | 5 (55.6%) | 3 (33.3%) | 1 | 2 | 6 | - | 9 (1.6%) | ||
O6 | 1989 | 11 (78.6%) | 8 (57.1%) | 8 (57.1%) | 9 (64.3%) | 8 (57.1%) | 8 (57.1%) | 5 | - | 9 | - | 14 (11.4%) | |
2010-2014 | 43 (100%) | 30 (69.8%) | 27 (62.8%) | 26 (60.5%) | 30 (69.8%) | 25 (58.1%) | 2 | 2 | 30 | 9 | 43 (7.7%) | ||
O7 | 1989 | 1 (100%) | - | - | - | - | - | - | - | - | 1 | 1 (0.8%) | |
2010-2014 | 3 (60%) | 1 (20%) | 1 (20%) | 1 (20%) | - | - | 2 | - | 1 | 2 | 5 (0.9%) | ||
O8 | 1989 | 6 (66.7%) | - | 1 (11.1%) | - | - | - | 2 | 2 | 1 | 4 | 9 (7.3%) | |
2010-2014 | 17 (85%) | 3 (15%) | 1 (5%) | 2 (10%) | 2 (10%) | - | 5 | 6 | 7 | 2 | 20 (3.6%) | ||
O15 | 1989 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
2010-2014 | 17 (89.5%) | 1 (5.3%) | 9 (47.4%) | 3 (15.8%) | 8 (42.1%) | 1 (5.3%) | 4 | - | 2 | 13 | 19 (3.4%) | ||
O16 | 1989 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
2010-2014 | 14 (100%) | - | 4 (28.6%) | - | - | 1 (7.1%) | 2 | - | 9 | 3 | 14 (2.5%) | ||
O18 | 1989 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
2010-2014 | 15 (100%) | 2 (13.3%) | 3 (20%) | 6 (40%) | 4 (26.7%) | 3 (20%) | 3 | 1 | 6 | 5 | 15 (2.7%) | ||
O21 | 1989 | 4 (100%) | - | 4 (100%) | 3 (75.0%) | - | 4 (100%) | - | - | 4 | - | 4 (3.3%) | |
2010-2014 | 3 (100%) | 1 (33.3%) | 1 (33.3%) | - | 1 (33.3%) | 1 (33.3%) | 1 | 1 | - | 1 | 3 (0.5%) | ||
O22 | 1989 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | |
2010-2014 | 5 (100%) | - | 1 (20%) | 2 (40%) | - | - | - | - | 2 | 3 | 5 (0.9%) | ||
O25 | 1989 | 12 (100%) | - | - | 2 (16.7%) | - | - | - | - | 9 | 3 | 12 (9.8%) | |
2010-2014 | 110 (94%) | 12 (10.3%) | 37 (31.6%) | 10 (8.5%) | 24 (20.5%) | 17 (14.5%) | 7 | 5 | 96 | 9 | 117 (21.0%) | ||
O75 | 1989 | 12 (100%) | 1 (8.3%) | 6 (50.0%) | 8 (66.7%) | 1 (8.3%) | 2 (16.7%) | 1 | 1 | 8 | 2 | 12 (9.8%) | |
2010-2014 | 57 (95%) | 1 (1.7%) | 2 (3.3%) | 56 (93.3%) | 10 (16.7%) | - | 1 | - | 57 | 2 | 60 (10.8%) | ||
O83 | 1989 | 4 (100%) | - | - | 2 (50.0%) | - | - | - | - | 4 | - | 4 (3.3%) | |
2010-2014 | 2 (66.7%) | 1 (33.3%) | 1 (33.3%) | 1 (33.3%) | - | - | 1 | - | 2 | - | 3 (0.5%) | ||
Other serogroup | 1989 | 42 (76.4%) | - | 2 (3.6%) | 10 (18.2%) | - | 2 (3.6%) | 21 | 8 | 7 | 19 | 55 (44.7%) | |
2010-2014 | 118 (86.8%) | 19 (14%) | 31 (22.8%) | 30 (22.1%) | 30 (22.1%) | 10 (7.4%) | 27 | 13 | 42 | 54 | 136 (24.4%) |
1989년도와 2010-2014년도에 분리된 요로병원성 대장균의 병원성 인자와 계통분류군의 빈도는 Table 3과 같다. 1989년도 분리주에서 병원성 인자의 보유 빈도는
Frequency of virulence factor genes and phylogenetic groups of
Target | Strains isolated in | ||
---|---|---|---|
1989 (n=123) | 2010-2014 (n=558) | ||
VFs | 17 (13.8%) | 68 (12.2%) | |
103 (83.7%) | 517 (92.7%) | ||
40 (32.5%) | 152 (27.2%) | ||
14 (11.4%) | 146 (26.2%) | ||
26 (21.1%) | 208 (37.3%) | ||
16 (13.0%) | 99 (17.7%) | ||
PGs | A | 30 (24.4%) | 56 (10%) |
B1 | 11 (8.9%) | 31 (5.6%) | |
B2 | 49 (39.8%) | 344 (61.6%) | |
D | 33 (26.8%) | 127 (22.8%) |
Abbreviation: VFs, vrulence factor; PG, phylogenetic group
병원성인자 profile에 따른 계통분류군 분포는 Table 4와 같다. 총 6개의 virulence factors 중(
Virulence factor gene profiles and phylogenetic groups of
1989 | 2010-2014 | |||||||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
VF genotype | Phylogenetic group | VF genotype | Phylogenetic group | |||||||||||||||||||||
F | S | P | U | C | H | A | B1 | B2 | D | n=123 | F | S | P | U | C | H | A | B1 | B2 | D | n=558 | |||
+ | - | - | - | - | - | 10 | 11 | 13 | 20 | 54 (43.9%) | + | - | - | - | - | - | 28 | 29 | 72 | 62 | 191 (34.2%) | |||
+ | - | + | - | - | - | 1 | 1 (0.8%) | + | - | + | - | - | - | 64 | 18 | 82 (14.7%) | ||||||||
+ | - | - | + | - | - | 6 | 6 | 5 | 17 (13.8%) | + | - | - | + | - | - | 6 | 54 | 8 | 68 (12.2%) | |||||
+ | + | + | + | + | + | 7 | 7 (5.7%) | + | + | + | + | + | + | 1 | 30 | 31 (5.6%) | ||||||||
- | - | - | - | - | - | 13 | 1 | 4 | 18 (14.6%) | - | - | - | - | - | - | 15 | 5 | 4 | 24 (4.3%) | |||||
+ | - | + | - | + | - | 16 | 6 | 22 (3.9%) | ||||||||||||||||
+ | - | - | - | + | - | 1 | 7 | 12 | 20 (3.6%) | |||||||||||||||
+ | + | + | - | + | - | 1 | 1 (0.8%) | + | + | + | - | + | - | 1 | 16 | 17 (3.0%) | ||||||||
+ | - | + | - | + | + | 11 | 2 | 13 (2.3%) | ||||||||||||||||
+ | - | - | + | + | - | 1 | 1 (0.8%) | + | - | - | + | + | - | 1 | 9 | 10 (1.8%) | ||||||||
+ | + | - | - | - | - | 1 | 7 | 1 | 9 (1.6%) | |||||||||||||||
+ | - | + | + | - | - | 7 | 1 | 8 (6.5%) | + | - | + | + | - | - | 1 | 3 | 3 | 7 (1.3%) | ||||||
+ | + | + | - | + | + | 1 | 1 (0.8%) | + | + | + | - | + | + | 5 | 1 | 6 (1.1%) | ||||||||
+ | + | - | + | + | + | 2 | 2 (1.6%) | + | + | - | + | + | + | 6 | 6 (1.1%) | |||||||||
+ | + | - | + | - | - | 2 | 2 (1.6%) | + | + | - | + | - | - | 6 | 6 (1.1%) | |||||||||
+ | + | + | - | - | - | 5 | 5 (0.9%) | |||||||||||||||||
- | - | - | - | + | - | 3 | 3 (0.5%) | |||||||||||||||||
+ | + | - | + | + | - | 1 | 1 (0.8%) | + | + | - | + | + | - | 4 | 4 (0.7%) | |||||||||
+ | + | + | + | - | - | 5 | 5 (0.9%) | |||||||||||||||||
+ | + | + | + | + | - | 4 | 4 (0.7%) | |||||||||||||||||
- | - | - | + | - | - | 4 | 4 (0.7%) | |||||||||||||||||
- | + | + | - | + | - | 2 | 1 | 3 (0.5%) | ||||||||||||||||
- | - | + | - | - | - | 1 | 1 | 2 (0.4%) | ||||||||||||||||
+ | - | + | + | + | + | 2 | 2 (0.4%) | |||||||||||||||||
+ | - | - | - | - | + | 1 | 1 (0.8%) | + | - | - | - | - | + | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||
+ | - | - | + | - | + | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||||||||||
+ | - | + | - | - | + | 3 | 3 (2.4%) | + | - | + | - | - | + | 1 | 1 | 2 (0.4%) | ||||||||
+ | - | - | - | + | + | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||||||||||
+ | - | + | + | + | - | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||||||||||
- | + | + | - | - | - | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||||||||||
+ | + | + | + | - | + | 1 | 1 (0.8%) | + | + | + | + | - | + | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||
+ | + | + | + | - | - | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||||||||||
+ | - | + | + | + | + | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||||||||||
- | - | - | - | - | + | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||||||||||
+ | - | + | + | - | + | 4 | 4 (3.3%) | + | - | + | + | - | + | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||
- | - | + | - | - | + | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||||||||||
- | + | - | - | + | - | 1 | 1 (0.2%) | |||||||||||||||||
- | + | + | + | + | - | 1 | 1 (0.8%) | |||||||||||||||||
Total | 30 | 11 | 49 | 33 | 123 | Total | 56 | 31 | 344 | 127 | 558 |
Abbreviation: F,
요로감염은 성별에 관계없이 유발되는 질병의 대표적인 것으로 특히 여성이 남성보다 더 많이 감염되는 것으로 알려졌다(Magliano et al., 2012).
한편 multiplex-PCR을 이용하여 병원성인자의 보유율을 확인해본 결과, 1989년도 분리주에서
Clermont 등은 장외 병원성을 나타내는
본 연구에서는 1989년도와 2010년도부터 2014년도에 분리된 요로병원성 대장균을 대상으로 O-serogroup과 병원성인자 및 계통분류군의 분포 및 연관성을 종합적으로 분석하였다. 본 연구의 결과를 종합적으로 생각해 보았을 때, 요로병원성 대장균의 O-serogroup과 병원성인자 그리고 계통분류군이 밀접하게 연관이 있는 것으로 나타났으며, 특히 1989년도 분리주의 병원성인자 보유율보다 2010-2014년도 분리주의
"This Work was supported by the Masan University research grant in 2021".
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.