최근 소득수준의 향상과 생활방식의 다양화로 청결과 위생에 대한 요구도는 높아지고 있으며, 기후변화와 미세먼지, 환경오염에 따른 건선, 소양증, 아토피와 같은 피부질환이 지속적으로 증가하고 있다(Xie et al., 2016). 이는 생활 속 미생물과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고(Milligan et al., 2016), 아토피피부염의 경우 황색포도상구균이 피부 염증 부위에 집락을 형성하고 증상을 악화시키는 것으로 보고되고 있다(Matsui et al., 2000; Ogawa et al., 1994).
피부가려움증(소양증)은 건강보험심사평가원 자료에 따르면 지속적으로 증가하여 2021년 기준 100만명에 육박하는 것으로 보고하였고(National Health Insurance Service, 2022), 원인은 피부질환 외에도 신장질환, 림프종, 갑상선 기능항진증, 당뇨병과 같은 전신질환이 원인이 되기도 한다. 그러나 원인을 알 수 없는 경우도 30%를 차지하고 있어 정확한 원인파악을 위해 혈액검사, 세균, 진균 배양검사, 피부조직검사를 진행하기도 한다(Oh et al., 2019). 피부의 가려움증을 해결하기 위하여 천연물을 이용한 식품과 의약품, 화장품 등의 연구개발이 활발하게 이루어지고 있으며(Choi et al., 2017), 최근 기능성 화장품과 의약품의 중간적 개념으로 코스메슈티컬에 대한 요구도가 높아지며 약용식물이나 식용식물에 대한 활성 검증이 꾸준하게 이루어지고 있다(Kim, 2021).
피부소양증과 가려움증 완화에 대한 선행연구는 황금 추출물의 ECS 조절을 통한 비만세포 활성 억제(Ahn et al., 2021), 자초(Radix lithospermi)와 지실(Ponciri fructus)은 nerve growth factor (NGF)의 발현과 항히스타민효과(Park et al., 2016), 며느리배꼽 추출물의 β-hexosaminidase 활성억제 효과 등의 연구가 진행되었다(Yoon and Park, 2020).
산약(Diosocorea batatas)의 주 활성 성분은 amylase와 mucin, saponin, arginine으로 알려져 있고 피로회복, 혈당 저하, 소화 촉진 등의 효과도 있는 것으로 알려져 있다(Kang et al., 2014). 또한 항암 효과, 전립선 비대증 개선, 심혈관 질환 예방, 염증억제 효과가 있는 것으로 활발하게 연구가 이루어지고 있다(Park et al., 2020).
상백피(Morus alba)의 주 성분은 ursolic acid, betulinic acid, mulberrin, morusin, mulberroside 등이며(Chan et al., 2016), 항산화, 항염, 항바이러스, 천식치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Batiha et al., 2023). 또한 상백피는 폐암, 대장암, 혈액암 등에 항암효과를 보이고 있다(Park and Park, 2021).
메리골드(Tagetes erecta)는 주 성분이 carotinoid로 약 90%의 lutein과 zeaxanthin을 함유하여 최근 많은 관심을 받고 있다(Kim et al., 2021). 또한, 한의학에서는 금잔화 또는 천수국으로 알려져 있고 항균 효과(Kasiram et al., 2000), 항산화(Karadas et al., 2006), 상처치유 효과(Zitterl-Eglseer et al., 1997) 등이 있는 것으로 알려져 있다.
피부의 염증을 유발하는 여러 요인 중 하나인 미생물에서 대표 원인 균주로 Staphylococcus aureus와 Escherichia coli, Cubibacterium acnes 등이 있으며(Kim et al., 2016), 이 균주들은 피지 분비율을 높여 피부의 염증과 가려움증을 유발하는 것으로 보고되고 있다(Knor, 2005). 피부에 항균 효과가 있는 것으로 알려진 추출물은 편백나무 에탄올 추출물(Kim et al., 2019), 오배자 추출물, 참나무 목초액 추출물, 다양한 허브식물 등이 있는 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2021). 따라서 본 연구에서는 한약재로 이용되는 산약, 상백피, 메리골드의 E. coli와 S. aureus에 대한 항균 효과와 성장억제 효과를 검증하여 산약, 상백피, 메리골드 추출물을 가려움증 완화 화장품 원료로 활용 가능성을 확인하고자 한다.
천일한약방에서 구입한 산약(D. batatas), 상백피(M. alba), 메리골드(T. erecta)는 분쇄 후 주정(에탄올)과 1:4 (v/v)의 비율로 섞고 초음파추출기(Powersonic 410, Hwashin Technology, Busan, Korea)를 이용하여 30분간 추출한 후 80℃를 유지하며 3시간씩 2회 반복하여 추출하였다. 여과된 산약 추출물(DBEE), 상백피 추출물(MAEE), 메리골드 추출물(TEEE)은 진공 농축기(N-110, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 완전히 농축하여 desiccator에 24시간 보관 후 무게를 측정하였다. 각 시료의 회수율은 산약 3.5%, 상백피 18.7%, 메리골드 35.3%로 나타났다.
E. coli (KCTC 2441)와 S. aureus (KCTC 1621)를 한국생명공학연구원(Daejeon, Korea)에서 분양받아 nutrient agar와 broth (KisanBio, Korea)에 접종하여 37℃ incubator (Hanbaek Co., Bucheon, Korea)와 shaking incubator (200 rpm, Daehan Lab. Science, Namyangju, Korea)에서 24시간 배양하여 사용하였다.
E. coli와 S. aureus에 대한 DBEE, MAEE, TEEE의 항균 활성은 디스크 확산법을 이용하여 측정하였고, 두 균주 모두 NCCLS Guide Line M11-A6에 준하여 실험하였다(Piddock, 1990). 균주들은 평판배지에 20 μL 도말 접종 후, 평판배지의 표면에 밀착시킨 직경 8 mm의 멸균된 paper disk (Advantec, Toyo Roshi, Ltd., Tokyo, Japan)에 DBEE, MAEE, TEEE를 100, 250, 500 mg/mL 농도별로 각각 30 μL씩 점적하고 37℃ incubator에서 24시간 동안 배양 후 만들어진 투명환의 직경을 caliper (DC150/200-2, CAS, Yangju, Korea)로 측정하여 항균 활성을 분석하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 시행 후 평균값을 기록하였다.
E. coli와 S. aureus에 대한 DBEE, MAEE, TEEE 농도에 따른 최소억제농도(minimum inhibition concentration, MIC)을 측정하기 위하여 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 2.5, 5.0, 1.0 mg/mL 농도로 희석한 시료를 24 well plate에 2 mL씩 분주하였다. 균주는 600 nm에서 0.2의 흡광도를 보이는 농도로 20 μL를 접종 후 37℃에서 24시간 배양하고 OD600 값이 0.1 이하인 MIC 농도를 확인하였다.
최소살균농도(minimum bactericidal concentration, MBC)의 측정을 위해 MIC 측정이 끝난 plate에서 각 농도별 well에 50 μL씩 취하여 고체배지에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 집락 형성 유무를 판독하였다.
통계분석은 SPSS (version 26.0, Chicago, IL, USA)을 이용하여, E. coli와 S. aureus에 대한 DBEE, MAEE, TEEE의 항균 효과를 비교분석 하기 위하여 일원배치분산분석(One-way ANOVA)를 실시하였고, 사후 검증을 위하여 Ducan 기법을 활용하였다.
DBEE, MAEE, TEEE의 항균 효과는 디스크 확산법을 이용하여 분석하였고 그 결과는 Table 1에서 보는 것과 같다. DBEE는 E. coli에 대해 100 mg/mL 농도에서 9.34 mm, 250 mg/mL에서 12.05 mm, 500 mg/mL에서 14.70 mm의 항균 효과를 보였고(P<0.001), MAEE는 100 mg/mL 농도에서 13.97 mm, 250 mg/mL에서 17.40 mm, 500 mg/mL에서 19.01 mm의 항균 효과를 나타냈으며(P<0.001), TEEE는 100 mg/mL에서 10.18 mm, 250 mg/mL에서 13.81 mm, 500 mg/mL에서 16.61 mm로 농도 의존적인 항균 효과를 보였다(P<0.001). 또한 S. aureus에 대해 DBEE는 100 mg /mL 농도에서 16.58 mm, 250 mg/mL에서 18.96 mm, 500 mg/mL에서 20.95 mm의 항균 효과를 나타냈고(P<0.001), MAEE는 100 mg/mL 농도에서 14.16 mm, 250 mg/mL에서 18.69 mm, 500 mg/mL에서 21.76 mm로 항균 효과를 보였으며(P<0.001), TEEE는 100 mg/mL 농도에서 17.30 mm, 250 mg/mL에서 21.75 mm, 500 mg/mL에서 33.09 mm로 농도 의존적으로 항균 효과를 나타냈다(P<0.003). 그리고 각 균주의 시료에 따른 항균 효과를 가장 낮은 농도인 100 mg/mL에서 비교한 결과, E. coli에 대해서는 MAEE가 13.97 mm로 가장 컸고, TEEE는 10.18 mm, DBEE는 9.34 mm 순으로 억제대의 크기가 나타났고(P<0.001), S. aureus에 대해 TEEE가 17.30 mm로 가장 컸고, DBEE는 16.58 mm, MAEE는 14.16 mm 순으로 억제대의 크기 차이를 보여, 억제대의 크기 순으로 항균 효과가 강한 것으로 나타났다(P=0.010).
Anti-microbial effect of DBEE, MAEE, and TEEE against E. coli and S. aureus
Strain | Agent | Treatment conc. (mg/mL) | Inhibition zone diameter (mm) | t / F | P |
---|---|---|---|---|---|
E. coli | DBEE | 100 | 9.34±0.75a | 42.351 | <0.001 |
250 | 12.05±0.89b | ||||
500 | 14.70±0.43c | ||||
MAEE | 100 | 13.97±1.07a | 34.970 | <0.001 | |
250 | 17.40±0.44b | ||||
500 | 19.01±0.60c | ||||
TEEE | 100 | 10.18±0.47a | 226.990 | <0.001 | |
250 | 13.81±0.36b | ||||
500 | 16.61±0.25c | ||||
S. aureus | DBEE | 100 | 16.58±0.51a | 41.514 | <0.001 |
250 | 18.96±0.84b | ||||
500 | 20.95±0.27c | ||||
MAEE | 100 | 14.16±1.64a | 38.120 | <0.001 | |
250 | 18.69±0.50b | ||||
500 | 21.76±0.72c | ||||
TEEE | 100 | 17.30±0.65a | 17.963 | 0.003 | |
250 | 21.75±5.67a | ||||
500 | 33.09±0.82b |
Values with the same letter are not significant different by Duncan multiple range test (***P<0.001)
DBEE, MAEE, TEEE의 E. coli와 S. aureus에 최소성장억제 농도는 Table 2에서 보는 것과 같다. E. coli에 대한 최소성장억제 농도는 DBEE 2.5 mg/mL, MAEE와 TEEE는 1.6 mg/mL으로 MAEE와 TEEE의 농도가 낮았다. S. aureus에 대한 최소성장억제 DBEE 0.8 mg/mL, MAEE 1.6 mg/mL, TEEE 0.2 mg/mL로 TEEE가 가장 낮은 농도에서 최소성장억제효과를 보였다. E. coli와 S. aureus에 대한 최소성장억제 농도를 확인 후 그 이상의 농도에서 배양한 E. coli는 BHI plate에서, S. aureus는 BAP에서 도말 후 colony 형성 여부를 확인한 결과, 24시간 경과 후 E. coli는 DBEE, MAEE, TEEE에서 10, 5, 10 mg/mL의 농도에서, S. aureus는 5, 5, 2.5 mg/mL의 농도에서 모두 관찰되었다(Table 2).
MIC and MBC (24 h) of DBEE, MAEE, and TEEE against E. coli and S. aureus
Strain | Agent | Concentration (mg/mL) | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
0 | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.5 | 5.0 | 10 | |||
E. coil | DBEE | MIC | + | + | + | + | + | - | - | - |
MBC | + | + | + | + | + | + | + | - | ||
MAEE | MIC | + | + | + | + | - | - | - | - | |
MBC | + | + | + | + | + | + | - | - | ||
TEEE | MIC | + | + | + | + | - | - | - | - | |
MBC | + | + | + | + | + | + | + | - | ||
S. aureus | DBEE | MIC | + | + | + | - | - | - | - | - |
MBC | + | + | + | + | + | + | - | - | ||
MAEE | MIC | + | + | + | + | - | - | - | - | |
MBC | + | + | + | + | + | + | - | - | ||
TEEE | MIC | + | - | - | - | - | - | - | - | |
MBC | + | + | + | + | + | - | - | - |
DBEE, MAEE, TEEE가 농도별로 희석된 nutrient broth에 E. coli와 S. aureus를 접종한 후 3, 6, 12, 24시간 배양하며 시간별로 OD600 값을 측정하였다. E. coli에 대한 DBEE, MAEE, TEEE의 성장억제 효과는 24시간 동안 배양한 양성대조군의 흡광도인 0.476과 비교하였을 때 1 mg/mL에서 0.241, 0.177, 0.218이 나타났고, 2 mg/mL에서 0.192, 0.165, 0.157이 나타났으며, 4 mg/mL에서 0.160, 0.146, 0.109의 값을 보여주었다(Fig. 1, left panel). 그리고 S. aureus에 대한 DBEE, MAEE, TEEE의 성장억제 효과는 24시간 배양한 양성대조군의 흡광도인 0.620과 비교하였을 때 1 mg /mL에서 0.253, 0.118, 0.074가 나타났고, 2 mg/mL에서 0.200, 0.080, 0.088이 나타났으며, 4 mg/mL에서 0.152, 0.090, 0.088의 값을 보여주었다(Fig. 1, right panel).
고령화와 환경오염에 따른 피부가려움증의 증가로 의료기관을 방문하는 인구가 증가하며, 사회적, 경제적 손실을 발생시키고 있다(Kim, 2021). 소양증의 치료 방법인 스테로이드 치료제는 다양한 부작용을 발생시키고 있어 천연 성분의 기능성 원료에 대한 관심은 지속적으로 증가하고 있다(Kim et al., 2021). 특히 한약재와 함께 섭취가 가능한 식용식물들의 연구들이 활발하게 이루어지고 있으며 인삼, 대두, 계피, 감초, 마늘, 쑥, 녹차 등의 항염증 및 항균성, 미백 기능성에 대한 연구들이 이루어지고 있다(Choi et al., 2017: Park et al., 2016). 이에 본 연구에서는 DBEE, MAEE, TEEE의 E. coli와 S. aureus에 대한 항균 효과 및 성장억제 효과를 검증하여 피부가려움증 완화 화장품 기능성 원료로 활용 가능성을 검증하고자 한다.
E. coli에 대한 항균 효과는 DBEE, MAEE, TEEE 모두 농도 의존적으로 항균 효과를 보였으며, 동일한 농도에서 MAEE, TEEE, DBEE 순으로 상백피에서 가장 항균 효과가 높았다. 이는 브로콜리 추출물을 이용한 연구에서 에탄올 추출물은 10 mg/mL과 20 mg/mL 모두에서 억제대가 10 mm로 농도 의존적으로 항균력을 보이지 않아 본 연구와 차이를 보였다(Kim et al., 2016). 그러나 Jang and Yang (2020)의 연구에서는 붉나무 열매 추출물에서 50 mg /mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL의 농도에서 항균력을 검증한 결과 각 10 mm, 10.4 mm, 10.8 mm로 농도 의존적으로 항균 효과를 보였으며 100 mg/mL의 농도를 기준으로 산약보다 높고, 상백피와 메리골드보다는 낮은 항균력을 보였다. 또한 버섯발효 에탄올 추출물에서는 9.5~13.3 mm로 농도 의존적으로 항균 효과를 보였다(Kim, 2021).
S. aureus에 대한 항균 효과는 DBEE, MAEE, TEEE 모두 농도 의존적으로 항균 효과를 보였으며, 동일한 농도에서는 TEEE가 가장 높았고 DBEE와 MAEE 순으로 항균 효과를 보였다. 이는 Kim 등 (2016)의 연구에서 브로콜리 에탄올 추출물에서 1, 5, 10, 20 mg/mL의 농도로 항균 효과를 검증한 결과 10, 11, 11, 12 mm로 약한 농도 의존성을 보여 본 연구와 유사한 결과를 보였다. 또한 Jang and Yang (2020)의 연구에서 붉나무 열매 추출물에서 50, 100, 150 mg/mL의 농도에서 13.9, 16.6, 20.0 mm로 농도 의존적으로 항균 효과가 커져 본 연구와 유사한 결과를 보였으며, 항균 효과는 DBEE와 MAEE와 비슷하였고 TEEE 보다 항균 효과는 낮았다. 그러나 붉나무 열매 추출물의 용매의 종류에 따라서는 차이를 보였고 Ethyl acetate fraction를 용매로 사용한 경우에 S. aureus에 대한 항균 효과는 100 mg/mL를 기준으로 했을 때 본 연구에서 항균 효과가 가장 좋은 TEEE 17.30 mm보다 큰 19.3 mm를 보였다. 이런 점을 고려할 때 본 연구에서 에탄올 추출물 뿐만 아니라 다른 용매를 활용한 연구를 추가적으로 진행하여 항균 효과를 검증해 볼 필요성이 있다.
본 연구에서 E. coli에 대한 최소성장억제 농도는 DBEE 2.5 mg/mL, MAEE와 TEEE는 1.6 mg/mL였다. 이는 Jang and Yang (2020)의 연구에서 0.5 mg/mL로 나타난 것 보다는 높게 나타나 차이를 보였다. S. aureus에 대한 최소성장억제 농도는 TEEE가 0.2 mg/mL로 가장 낮았고 DBEE 0.8 mg/mL, MAEE 1.6 mg/mL으로 추출물에 따라 차이를 보였다. 이는 Jang and Yang (2020)의 연구에서 붉나무 열매 추출물에서 최소성장억제 농도가 0.5 mg/mL로 나타나 본 연구결과 TEEE의 최소억제농도 0.2 mg/mL가 더 낮게 나타났다. 또한 황칠나무 잎, 가지 추출물에서의 최소성장억제 농도는 발효 전 4.01 mg/mL, 발효 후 2.05 mg/mL로 본 연구결과보다 높은 농도를 보였다(Lee et al., 2019). Hwang 등 (2022)의 벌나무 추출물의 S. aureus에 대한 연구에서 최소성장억제 농도는 1~32 mg/mL에서는 균 성장률을 80% 이상 억제하였고 16 mg/mL 이상에서는 균이 성장하지 않았다.
본 연구에서 최소사멸농도(MBC)는 E. coli에서는 DBEE와 TEEE 10 mg/mL, DBEE는 5 mg/mL로 MAEE에서 농도가 낮았다. 이는 오배자 추출물에서 20 mg/mL로 나타난 결과보다 모든 시료의 최소사멸농도가 낮았다. 또한 S. aureus에서는 DBEE와 MAEE는 5 mg/mL, TEEE는 2.5 mg /mL로 TEEE에서 낮았다. 이는 오배자 추출물에서 10 mg /mL에서 최소사멸농도가 나타난 것 보다 더 낮은 농도에서 나타났다(Kim et al., 2021).
본 연구에서 DBEE, MAEE, TEEE의 E. coli와 S. aureus에 대한 성장억제 효과는 24시간 후 모두 억제됨을 확인할 수 있었다. 성장억제 효과는 농도 의존적으로 억제되었고, E. coli와 S. aureus 모두에서 TEEE에서 성장억제 효과가 가장 컸으며, E. coli보다 S. aureus에서 효과성이 높았다. 이는 솔잎 정유를 이용한 연구에서 E. coli와 S. aureus 모두에서 농도 의존적으로 성장이 억제 효과를 보였으며(Sung, 2004), 오미자 추출물에서 E. coli와 S. aureus에 성장억제 효과를 보여 본 연구결과와 유사한 결과를 보였다(Choi et al., 2013).
DBEE, MAEE, TEEE 모두 E. coli와 S. aureus에 대한 항균 효과와 성장억제 효과를 보여 가려움증 완화를 위한 기능성 화장료로 활용할 수 있는 기반을 마련하였다. 그러나 추가적인 연구를 통하여 추출하는 용매에 따른 항균 효과와 항히스타민능을 검증하고 이를 기반으로 임상시험을 진행하여 화장료로 활용 가능성을 높이고자 한다.
This study was supported by Busan Technopark Foundation (2023 Busan Local Government-Industry-Academia Collaboration Corporate R&D Support Project).
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.