골격근(skeletal muscle)은 인체에서 가장 풍부한 조직으로, 우리 몸의 약 40% 정도를 차지하고 있다. 골격근은 신체의 움직임과 관련된 기본적인 기능 외에도 자세를 유지시켜주고, 열을 발생시키는 중요한 역할을 수행한다. 또한, 물질 대사를 위한 에너지원인 포도당과 지방산 같은 주요 영양소의 흡수를 조절하고 이용함으로써 인체의 에너지 대사에 크게 기여할 뿐만 아니라, 마이오카인(myokine)과 같은 근육에서 생성되어 분비되는 사이토카인(cytokine)을 분비함으로써 인체의 면역체계를 조절한다(Silveira et al., 2011; Nelke et al., 2019; Merz and Thurmond, 2020). 근육량을 유지하기 위해서는 근육의 단백질 합성과 분해 간의 균형을 이루어야 하는데 신경 손상, 근소실, 노화, 약물독성, 심부전을 포함한 여러 병리학적 상태는 이러한 균형을 깨트릴 수 있다. 근육의 단백질 합성과 분해 간의 불균형 상태는 골격 근육의 질량과 기능의 점진적인 손실을 특징으로 하는 골격근 위축(muscle atrophy)를 유발할 수 있다(Wang et al., 2022; Burcin Kubat et al., 2023). 골격근 위축은 삶의 질에 심각한 영향을 미치는데 특히, 인슐린 저항성과 제2형 당뇨병과 같은 대사 이상 질병을 유발하여 합병증을 발생시키고 이로 인한 조기 사망의 위험을 높일 수 있다(Mesinovic et al., 2019; Shou et al., 2020). 따라서 인체의 전반적인 건강을 유지하기 위해서는 건강한 골격근을 유지하는 것이 중요하다.

골격근 분화(skeletal muscle differentiation)는 근발생(myogenesis)이라고도 하며, 근육모세포(myoblast)의 증식을 시작으로 여러 개의 근육모세포들이 서로 융합되어 관 형태의 다핵세포인 근관세포(myotube)를 형성하는 정교하게 조화된 다단계 과정이다(Comai and Tajbakhsh, 2014). 마우스 근육모세포에서 유래된 C2C12 세포주는 인체의 골격근 분화 과정을 체외(in vitro)에서 효과적으로 발생시키고 근육 형성의 기저 메커니즘을 조사하기 위한 최적의 세포 시스템을 제공한다(Dias et al., 1994; Buckingham, 2006). 근발생은 근육 조절 인자(myogenic regulatory factors; MRF)의 순차적 발현에 의해 조절된다. MRFs의 종류에는 myoblast determination protein 1 (MyoD), myogenic factor 5 (Myf-5), myogenin 및 MRF4가 있으며, 이들은 염기성 나선-고리-나선(basic helix-loop-helix) 전사 인자에 속한다(Ferri et al., 2009; Londhe and Davie, 2011). 이들 네 가지 MRF의 각각을 다양한 비근육세포를 배양할 때 처리하면 근육 형성을 잘 유도할 수 있다. 그러나 myocyte enhancer factor 2 (MEF2)와 같은 다른 근육 전사 인자의 도움이 필요하다. MEF2 인자는 근육 분화에 필수적이며, MRF와 MEF2는 협동적으로 전사를 활성화시켜서 근육 형성을 일으키게 된다(Dodou et al., 2003; Liu et al., 2014). Myf5와 MyoD는 근발생 초기에 일어나는 근육모세포의 증식 이후에 발현을 하여 근육모세포가 분화를 시작하도록 자극한다(Rudnicki et al., 1993). Myogenin과 MRF4는 그 후에 발현하여 세포 융합을 촉진한다(Sabourin and Rudnicki, 2000). 분화 후기에 이르면 muscle creatine kinase (MCK)와 myosin heavy chain (MyHC) 같은 종말 분화(terminal differentiation) 인자와 구조 단백질의 발현이 증가한다. 근발생의 정도는 이러한 근발생 관련 인자들의 발현을 측정함으로써 확인할 수 있다. 최종적으로 분화가 완료되면, 근육의 크기가 증가하는데, 이는 근육 단백질의 합성 증가로 인한 근관세포의 지름과 길이가 증가하는 근비대(muscle hypertrophy) 과정을 통해서 이루어진다(Schiaffino et al., 2013).

Protein kinase B (Akt)는 근육에서 단백질 합성을 조절하여 근비대를 촉진시키는 작용을 하는 세린-트레오닌 계열의 키나제(serine-threonine kinase)이다. 동물실험 연구결과에서 Akt 활성화는 신경절단에 의해 유발된 근위축을 예방한 반면, Akt 활성의 감소는 진행성 근위축(muscular atrophy)을 유발하였다(Bodine et al., 2001; Leger et al., 2006). Akt 활성은 포크헤드 박스(forkhead box) 단백질을 인산화하여 E3-ubiquitin ligases인 atrogin-1과 muscle ring fnger-1 (MuRF-1) 같은 근위축 인자의 전사를 억제할 수 있는데, 이러한 근위축 인자의 전사가 억제되지 못하면 근육 손실이 발생하게 된다(Wang et al., 2019). 따라서 Akt 활성의 감소는 근육 분해 과정을 강화하는 근위축 인자의 발현을 증가시킬 수 있다.

Trans-anethole (TA; 1-methoxy-4-((E)-propenyl)-benzene)은 식물에서 테르펜(terpene) 생합성의 부산물로 형성되는 테르페노이드(terpenoid)로서, 펜넬(fennel), 아니스(anise) 또는 스타아니스(star anise)와 같은 향기로운 식물의 에센셜 오일(essential oil)의 주요 성분이다(Ponte et al., 2012; Moradi et al., 2014). 토끼에서 TA의 급성독성시험 결과 반수치사량(LD50)이 5,000 mg/kg 이상의 농도로 확인되었고 저용량에서는 유전독성이나 발암성이 감지되지 않았기 때문에 TA는 상당히 안전한 물질로서 알려져 있다(Shimoni et al., 2002; Kwiatkowski et al., 2020). 또한, TA는 식품 및 제약산업에서 사용되고 있으며, 미국 식품의약국(FDA-US)은 그 안전 인증을 발급하였다(Ponte et al., 2012). 식품에서는 독특한 맛과 향 때문에, 주로 사탕, 아이스크림, 껌, 알코올 음료와 같은 다양한 종류의 음식에 주로 사용된다(Shimoni et al., 2002; Ryu et al., 2005). 제약산업에서는 항균, 항진균, 살충, 살란, 항산화, 항염, 항통증, 면역 조절, 항암, 항혈전, 당뇨병 예방, 불안 감소, 국소마취, 위 보호, 및 상처 치유의 특성을 나타내기 때문에 첨가제로 사용된다(Yea et al., 2006; Huang et al., 2010; Shahat et al., 2011; Aprotosoaie et al., 2016; Kim et al., 2017; Zhang et al., 2018; Kwiatkowski et al., 2019). 그러나 TA가 근발생에 미치는 영향에 대한 보고는 아직까지 없다.

본 연구에서는 TA가 C2C12 근육모세포의 분화에 미치는 영향을 조사하였는데 TA가 근위축 유전자인 atrogin-1과 MuRF-1의 발현 증가와 Akt 발현 감소를 통해 C2C12 근육모세포의 분화를 억제하는 역할을 한다는 것을 증명하였다. 본 연구결과는 근위축에 대한 위험 인자를 가진 사람에게 TA가 미칠 수 있는 영향에 대한 귀중한 통찰력을 제공한다.

세포 배양 및 시약

마우스 C2C12 근육모세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였으며, 10% FBS와 1% P/S를 함유한 DMEM 배양배지(growth medium; GM)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. 세포의 밀도(confluency)가 70%에 도달할 때 계대 배양하였다.

TA는 ChromaDex (Irvine, CA, USA)로부터 구입하였고, 0.1% Tween 80 용액에 녹여 50 mg/mL 저장용액(stock solution)을 제조한 후, -20℃에서 실험에 사용할 때까지 보관하였다. 실험 전 TA 저장용액이 배양배지를 이용하여 무균적으로 희석되었다. Dulbeccós modified Eagle medium (DMEM)은 Welgene, Inc. (Daegu, Korea)로부터 구입하였다. Horse serum과 TRIzol은 Invitrogen (Grand Island, NY, USA)으로부터 구입하였다. Fetal bovine serum (FBS)과 penicillin/ streptomycin (P/S)는 GE Healthcare Life Sciences (Logan, UT, USA)로부터 구입하였다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)와 lactate dehydrogenase (LDH)는 Promega (Madison, WI)로부터 구입하였다. cDNA synthesis kit는 Enzynomics (Daejeon, South Korea)로부터 구입하였다. SYBR Green Master Mix Reagent, RIPA buffer, proteinase inhibitor, phosphatase inhibitor, goat anti-rabbit IgG-HRP-conjugate 이차 항체는 GenDEPOT (Katy, TX, USA)로부터 구입하였다. BCA Protein assay reagent는 Pierce (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였고, polyvinylidene fluoride (PVDF)는 Bio-Rad (Hercules, CA, United States)로부터 구입하였다. Phosphorylated (p-)Akt (Ser473; #4060)와 Akt1/2/3 (#9272) 일차 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로부터 구입하였고 β-actin 일차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.

분화 유도 및 TA의 처리

C2C12 근육모세포를 GM을 포함하는 6-well plates에서 배양하였다. 세포의 융합과 근관세포의 형성을 유도하기 위하여 세포의 밀도가 80~90%에 도달할 때 2% horse serum과 1% P/S를 포함하는 분화배지(differentiation medium; DM)로 교체해 주었다. TA의 효과를 알아보기 위해서 50과 200 μg/mL의 농도로 TA를 GM에 각각 처리하였고 대조군(vehicle)에는 TA를 녹인 용매인 Tween 80을 처리하였다. 분화 유도 기간 동안 매일 TA와 vehicle을 포함하는 신선한 DM으로 교체해 주었다.

세포생존율 및 세포독성 측정

TA에 의한 C2C12 근육모세포의 세포생존율을 MTT assay를 통해 확인하였다. C2C12 근육모세포를 DM을 포함하는 6-well plates에서 배양하였고, 배양 기간 동안 TA 25, 50, 100, 200 및 400 μg/mL를 처리하였다. 24 또는 72시간 후에 각 well의 상층액은 LDH assay에 이용하기 위해서 제거한 후 따로 보관하였고, 세포는 MTT (0.5 mg/mL)를 첨가한 신선한 DM에서 2시간 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 이후 형성된 formazan 화합물을 dimethyl sulfoxide에 용해시켜 100 μL씩 96-well plates로 옮긴 후 microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포독성은 LDH assay kit를 이용하여 세포막 손상 정도를 측정하였다. 약 50 μL의 세포 배양액에 동량의 LDH 기질 혼합물을 넣고 30분 동안 상온에서 차광하여 반응시킨 후, microplate reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 형태 관찰

세포의 형태학적인 관찰은 세포를 배양 중인 용기를 직접 위상차 현미경(Leica DM IL, Germany) 하에 놓고 관찰하였으며 필요 시 부착된 사진기로 촬영하였다. 근관세포의 길이와 지름을 ImageJ software (NIH, Frederick, MD, USA)를 사용하여 무작위로 선택된 10개의 필드에서 가장 큰 근관세포 50개의 평균 값으로 나타내었다(Nguyen and Wang, 2015).

RNA 추출 및 quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 분석

50 또는 200 μg/mL 농도의 TA와 함께 1, 3, 5일 배양시킨 C2C12 근육모세포로부터 TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA의 1 μg으로부터 TOPscript^TM RT DryMIX cDNA synthesis kit를 사용하여 cDNA를 합성하였고, Quantstudio3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems)에서 SYBR Green PCR master mix를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분간 초기 변성을 시행하였고, 95℃에서 3초, 60℃에서 30초의 2-step 증폭반응을 40회 시행하였다. Housekeeping gene으로는 β-actin을 사용하여 internal control로 사용하였다. 실험에 사용된 primer의 염기서열은 MyoD의 경우 forward는 5'-ACTTTCTGGAGCCCTCCTGGCA-3', reverse는 5'-TTTGTTGCACTACACAGCATG-3'이고, myogenin의 경우 forward는 5'-CTTGCTCAGCTCCCTCAACC-3', reverse는 5'-GTTGGGACCGAACTCCAGTG-3'이고, MEF2C의 경우 forward는 5'-TGATCAGCAGGCAAAGATTG-3', reverse는 5'-ATCAGACCGCCTGTGTTACC-3'이고, MCK의 경우 forward는 5'-CTTCATGTGGAACGAGCACCTG-3', reverse는 5'-GCGTTGGAGATGTCGAACACG-3'이고, MyHC의 경우 forward는 5'-AGGGAGCTTGAAAACGAGGT-3', reverse는 5'-GCTTCCTCCAGCTCGTGCTG-3'이고, MuRF-1의 경우 forward는 5'-GGAACCTGCTGGTGGAAAACATC-3', reverse는 5'-CGTCTTCGTGTTCCTTGCAC-3'이고, Atrogin-1의 경우 forward는 5'-GCAGAGAGTCGGCAAGTC-3', reverse는 5'-GCAGGTCGGTGATCGTGA-3'이며, β-actin의 경우 forward는 5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3', reverse는 5'-CACAGGATTCCATACCCAAGAAG-3'이다.

단백질의 분리 및 Western blot 분석

C2C12 근육모세포와 분화된 근관세포를 phosphate-buffered saline을 이용하여 2회 세척을 한 후 protease inhibitors와 phosphatase inhibitors가 첨가된 RIPA buffer에 녹여서 단백질을 추출하였다. 14,000 × g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하고 상층액을 취해 BCA protein assay kit를 이용하여 단백질의 함량을 측정하였다. 단백질의 농도를 15 μg으로 동일하게 정량하여 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 하였고, PVDF membrane으로 Transfer 한 후에 5% nonfat milk가 첨가된 TBST buffer (150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, and 20 mM Tris-HCl, pH 7.4)를 이용하여 1시간 동안 blocking 하였다. Blocking 후에 PVDF membrane을 1:1,000으로 희석한 일차 항체와 4℃에서 overnight 동안 반응시켰고 TBST buffer로 5회 세척 후 1:5,000으로 희석한 horseradish peroxidase-conjugated 이차 항체로 1시간 동안 반응시켰다. 단백질의 발현은 ECL kit와 Davinch-Chemi^TM Imaging system (Core Bio, Seoul, Korea)을 이용하여 확인하였고, ImageJ software (NIH, Frederick, MD, USA)를 사용하여 단백질 발현량을 정량적으로 분석하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 반복 실시하였으며, 실험결과는 평균 ± 표준편차(S.D.)로 표기하였다. 통계적 유의성을 검증하기 위하여 unpaired two-tailed Student's t-test를 수행하였으며, P-value < 0.05의 값들을 유의적인 결과로 판단하였다.

C2C12 근육모세포에서 TA가 세포생존율과 세포독성에 미치는 영향

근육세포 분화에서 TA의 효과를 연구하기 위해서, 마우스 C2C12 세포가 "재료 및 방법"에 설명된 대로 분석되었으며, Fig. 1에 C2C12 세포의 분화 과정 동안 TA를 처리한 전체 실험 구조를 간략화 하여 그림으로 나타내었다. 먼저 TA가 C2C12 근육모세포의 세포생존율과 세포독성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 다양한 농도(0, 50, 100, 200 및 400 μg/mL)의 TA를 24시간 또는 72시간 동안 처리하였다. 세포생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였고, 세포독성을 확인하기 위하여 LDH assay를 실시하였다. Fig. 2A와 2B에 나타낸 결과에서 알 수 있듯이, 본 연구에서 설정된 범위의 TA 처리 조건에서는 세포생존율의 저하 현상이 관찰되지 않았고 세포독성이 없음을 확인하였다. 따라서 C2C12 근육모세포의 분화에 대한 TA의 영향을 평가하기 위하여 TA 처리 농도는 저농도(50 μg /mL)와 고농도(200 μg/mL)의 두 가지 농도로 설정하였다.

Fig. 1. C2C12 differentiation time course.
C2C12 myocytes were plated in GM until 80~90% confluence and then grown in DM with or without 50 or 200 μg of TA. Culture samples were analyzed for the morphologic and molecular phenotype studies from four time points: growth medium (GM), day 1 (DM1), day 3 (DM3), and day 5 (DM5).

Fig. 2. Effect of TA on cell viability (MTT) and cytotoxicity (LDH) in C2C12 cells.
C2C12 cells were treated with DM containing TA in a dose-dependent manner (0, 50, 100, 200, and 400 μg). MTT (A) and LDH (B) assays were conducted 24 and 72 h after the treatments to determine cell viability and cellular toxicity, respectively. The experiment was repeated three times. Results are expressed as mean ± SD and percentage of the vehicle controls.

C2C12 근육모세포의 분화 과정에서 TA가 세포형태학적 변화에 미치는 영향

TA의 근육세포 분화에 대한 효과를 평가하기 위해서, C2C12 근육모세포가 근관세포로 분화하는 동안의 형태학적 변화에 대한 TA의 영향을 조사하였다. C2C12 근육모세포의 증식을 유도하기 위해서 GM에서 배양하였고, 분화를 유도하기 위해서 세포의 밀도가 80~90%에 도달할 때 50 또는 200 μg/mL의 TA를 포함하거나 vehicle을 포함하는 DM으로 교체하여 배양하였다. 5일 동안 분화를 유도하는 동안 TA로 처리한 세포에서 근관 형성 능력이 TA 농도 의존적으로 뚜렷하게 감소하는 것을 관찰하였다(Fig. 3A). 또한, 배양 종료 시점(분화 5일째)의 형태학적 이미지에서 C2C12 근관세포의 길이와 지름을 측정하였는데, TA를 처리한 C2C12 세포는 vehicle 대조군보다 유의적으로 더 짧고 좁은 근관세포를 형성하였다(Fig. 3B and C). 이러한 결과를 통해 TA가 C2C12 근육모세포의 분화에서 근위축 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

Fig. 3. TA suppresses the morphological change of C2C12 myoblasts differentiating into myotubes.
C2C12 cells were cultured in DM to induce differentiation and were treated with or without 50 or 200 μg of TA for 5 days. (A) Phase-contrast images of cell morphology were obtained at the indicated time points. Scale bar, 100 μm. (B) Myotube length and (C) diameter were quantified at the end of the experiment (5th day). Results are expressed as mean ± SD. *P<0.05 compared with the vehicle controls.

C2C12 근육모세포의 분화에서 TA가 근육 표지 인자(myogenic marker)의 발현에 미치는 영향

TA가 C2C12 근육모세포의 분화 과정에서 나타나는 세포 융합 및 근관 형성과 같은 형태학적 변화에 영향을 주었기 때문에, 분화 과정에서 발현이 증가한다고 알려진 근육 표지 인자들(MyoD, myogenin, MEF2C, MCK 및 MyHC)의 발현에서 TA의 영향을 조사하였다. C2C12 근육모세포가 80~90%의 밀도로 증식할 때까지 GM에서 배양하였고, 그 후 배지를 50 또는 200 μg/mL의 TA를 포함하거나 vehicle을 포함하는 DM으로 교체하여 분화를 유도하였다. 분화 유도 후, 1, 3, 및 5일째 근육 표지 인자들의 발현 수준을 확인하기 위해 세포를 수확하여 qRT-PCR 분석을 시행하였다. 그 결과, vehicle을 처리한 대조군에 비해 TA를 처리한 C2C12 세포에서 근육 표지 인자들의 mRNA 발현이 TA 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4). 따라서 TA에 의한 근육 표지 인자들의 전사적 변화가 TA에 의한 근위축 현상에 중요하게 기여할 것이라는 점을 알 수 있다.

Fig. 4. TA decreases the expression of myogenic markers during myoblast differentiation.
C2C12 cells were cultured in DM and were treated with or without 50 or 200 μg of TA. The cells were harvested on differentiation days 1, 3, and 5. qRT-PCR was performed to assess the expression of MyoD, myogenin, MEF2C, MCK, and MyHC during myoblast differentiation. Results are expressed as mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared with the vehicle controls.

C2C12 근육모세포의 분화에서 TA가 Akt를 매개로 하는 근위축 관련 인자 조절에 미치는 영향

근육세포에서 Akt는 비대와 위축 간의 균형을 조절하고, MyoD, myogenin, MEF2C, MCK, 및 MyHC를 포함하는 근육 특이적 유전자들(muscle-specific genes)의 발현을 조절하는 데 매우 중요한 역할을 한다고 보고되었다(Jiang et al., 1999; Xu and Wu, 2000; Bodine et al., 2001; Leger et al., 2006). 따라서, TA가 C2C12 근육모세포의 분화 과정에서 Akt의 활성화 및 인산화를 조절하는지 조사하기 위해서, C2C12 근육모세포를 TA 200 μg/mL을 포함하거나 vehicle을 포함하는 DM으로 배양하여 분화를 유도한 후, 분화 3일 또는 5일째 세포를 수확하여 Western blot을 실시하였다. 그 결과, vehicle을 처리한 대조군에 비해 TA를 처리한 C2C12 세포에서 Akt의 인산화(p-Akt)가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, TA를 처리한 세포에서 total Akt 단백질의 발현이 p-Akt의 감소 수준과 비슷하게 감소하였는데, 이는 TA에 의한 p-Akt의 감소는 total Akt 단백질 발현의 감소에 의한 것임을 의미한다(Fig. 5A and B, top panel). Loading control로서 β-actin을 사용하여 p-Akt 양의 변화양상을 상대적으로 비교 정량 하였다(Fig. 5A and B, bottom panel). 다음으로, atrogin-1과 MuRF-1 유전자가 Akt 신호전달 경로에 의해 발현이 조절되고 근육 단백질의 파괴 및 근위축의 주된 조절 인자로 보고되었기 때문에(Wang et al., 2019), 이 두 유전자의 mRNA 발현을 qRT-PCR을 이용하여 분석하였다. Fig. 5C에 나타낸 바와 같이 vehicle을 처리한 대조군에 비해 TA를 처리한 C2C12 세포에서 atrogin-1과 MuRF-1 발현이 TA 농도 의존적으로 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 5C). 이러한 결과는 C2C12 근육모세포의 분화에서 TA가 total Akt 발현 감소로 인한 Akt 인산화 억제를 통해 근위축을 유발하는 것으로 보여진다.

Fig. 5. TA upregulates atrophy-related genes by inhibiting the expression of total Akt and p-Akt.
C2C12 cells were cultured in DM with or without 50 or 200 μg of TA and were harvested on days 1, 3, and 5 of differentiation. (A, B) Protein expression levels of Akt, p-Akt and β-actin were analyzed using western blot analysis, and representative images of the protein band are shown in the top panel. Band intensities were quantitated using computerized densitometry and are shown in the bottom panel. The expression levels of p-Akt were normalized to those of β-actin, and the fold change relative to vehicle-treated cells is presented. (C) Atrogin-1 and MuRF-1 expression were analyzed using qRT-PCR during myoblast differentiation. Results are expressed as mean ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared with the vehicle controls.

본 연구는 펜넬, 아니스, 스타아니스와 같은 향기로운 식물로부터 유래하는 에센셜 오일의 대표 성분인 TA가 C2C12 근육모세포의 분화에서 미치는 영향을 조사하는 것을 목표로 하였다. 본 연구에서 TA는 C2C12 근육모세포의 분화 동안 total Akt 발현 감소와 이로 인한 Akt 인산화 억제를 통해 근위축을 유발하였으므로 근육 분화에서 유해 효과(adverse effect)를 나타내는 물질임을 확인하였다. 지금까지 펜넬, 아니스, 스타아니스 유래의 에센셜 오일뿐만 아니라 그 주요 성분들에 대한 다양한 치료 효과가 보고되었음에도 불구하고(Gülçın et al., 2003; Espejo et al., 2010; Shojaii and Abdollahi Fard, 2012), 근육 건강에서의 역할은 알려진 정보가 거의 없다. 본 논문은 펜넬, 아니스, 스타아니스와 같은 향기로운 식물에서 유래하는 물질이 근육 형성에 미치는 영향을 밝히는 첫 번째 연구이다.

에센셜 오일은 다양한 식물부위에서 추출한 휘발성 방향족 화합물로서, 최소 6,000년 동안 이집트, 중국, 인도의 고대 문명에서 보완대체요법으로 사용되어 왔다(Ali et al., 2015). 에센셜 오일은 항염증, 항통증, 항세균, 항진균 및 항산화 특성을 포함하여 수많은 약리학적 특성을 가지고 있다(Mouhoub et al., 2022; Santos et al., 2022). 또한, 스트레스, 불안, 우울증과 같은 다양한 정신 건강 장애를 완화하기 위한 향기요법(aromatherapy)의 용도로서 널리 사용되고 있고(Ebrahimi et al., 2022), 수면 장애, 알츠하이머병, 심혈관 합병증 및 암과 같은 여러 질환에 대한 치료를 위해 활용되고 있다(Ramsey et al., 2020). 에센셜 오일은 자연유래의 순수한 천연물질이므로 합성 의약품에 비해 비교적 안전한 대안으로 인식되고 있고, 누구나 쉽게 구입할 수 있으며, 일반적으로 비용면에서 효율적이다. 따라서, 에센셜 오일은 합성 의약품의 부작용을 줄이고 높은 치료 비용을 절감하는 혁신적인 치료법을 개발할 수 있는 좋은 대안으로 여겨진다. 그러나, 에센셜 오일이 천연물질임에도 불구하고 알레르기, 피부염, 신경독성, 중독 및 사망을 포함하여 경미한 증상부터 심각한 증상에 이르는 부작용이 다양하게 보고되었다(Dagli et al., 2015). 따라서 건강의 유익을 제공하는 동시에 부작용을 최소화할 수 있는 에센셜 오일을 찾는 것이 중요하다.

펜넬, 아니스, 스타아니스로부터 추출한 에센셜 오일에서 수많은 유효 성분(active ingredient)이 확인되었으며, 그 중 TA가 차지하는 함량이 펜넬에서는 50~80%, 아니스에서는 80~90%, 스타아니스에서는 90% 이상으로 가장 높게 나타났다(Zachariah and Leela, 2006; Orav et al., 2008; Damayanti and Setyawan, 2012). 펜넬, 아니스, 스타아니스의 에센셜 오일을 지속적, 정기적으로 섭취했을 때 아직까지 부작용이 보고된 바가 없기 때문에 이 오일이 천연물 기반 치료의 유망한 후보물질 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대되어지고 있다(Shimoni et al., 2002; Kwiatkowski et al., 2020). 그러나, 본 연구에서 C2C12 근육모세포의 분화를 위해 TA를 사용하였을 때 근위축이 유발되는 것을 증명하였는데, 이는 펜넬, 아니스, 스타아니스의 에센셜 오일뿐만 아니라 TA를 함유하는 물질을 고용량으로 사용하거나 지속적, 정기적으로 사용했을 때 TA로 인한 근위축의 부작용이 유발할 수 있음을 시사하는 결과이다.

근위축증은 근육의 질량과 힘의 점진적인 손실을 특징으로 하는 질환으로, 근관의 직경 감소가 이 질환의 가장 두드러진 조직병리학적 특징이다(Yin et al., 2021). 근위축증에 의한 근육 손상은 자유로운 움직임을 방해하여 신체활동을 감소시키기 때문에 삶의 질을 크게 떨어뜨리고 여러 급성질환을 유발하여 사망률을 증가시키게 된다(Mesinovic et al., 2019; Shou et al., 2020). 근위축증은 노화 관련 근소실, 암성 악액질, 만성 폐쇄성 폐질환, 당뇨병, 비만, 만성 신장질환, 심부전, 신경퇴행성 장애, 패혈증, 화상 및 외상으로 인해 발생할 수 있다(Yin et al., 2021). 근위축에 대한 치료 전략으로는 체력 운동, 영양 보충제 및 약물이 포함되지만 아직까지 근위축에 대한 효과적인 치료제는 시장에 출시되지 않았으며 효과적인 치료법도 개발되지 않았다. 근위축을 조절하는 분자 메커니즘에는 ubiquitin-proteasome 시스템, 자가포식(autophagy), 염증, insulin-like growth factor 1/PI3K/Akt 신호 전달 경로 및 마이오스타틴 경로가 알려져 있다(Kubat et al., 2023). 본 연구에서는 TA가 total Akt 발현 감소로 인한 Akt 인산화를 억제시켜서 ubiquitin ligase인 atrogin-1 및 MuRF-1의 발현을 증가시켰기 때문에, 근위축 조절 메커니즘 중에서 insulin-like growth factor 1/PI3K/Akt 신호전달 경로 및 ubiquitin-proteasome 시스템 경로와 연관되어 있다는 것을 알 수 있다. 그러나 TA가 다른 근위축 조절 메커니즘에도 영향을 미치는 물질인지 확인하기 위한 추가 연구가 필요하다.

결론적으로 본 연구에서는 TA가 근위축 유도물질임을 확인하였다. TA는 total Akt 발현 감소와 이로 인한 Akt 인산화를 억제하여 근육 표지 인자들의 발현을 감소시키고, 근육 위축 관련 ubiquitin ligase 유전자 발현을 증가시킴으로써 C2C12 근육모세포의 분화에서 근위축 현상을 유발하였다. 본 연구결과는 펜넬, 아니스, 스타아니스 유래의 에센셜 오일뿐만 아니라 TA를 주요 성분으로 함유하는 물질을 고용량으로 사용하거나 지속적이고 정기적으로 사용한다면 부작용으로써 근위축이 발생할 가능성이 있다는 것을 시사한다. 따라서 근위축에 대한 위험요소를 가지고 있는 사람에게 TA를 포함하는 물질을 사용할 때 각별한 주의가 필요할 수 있으므로 임상시험을 통해 근위축에서 TA의 안전성과 유효성을 검증하는 과정이 요구된다.

This work was supported by the Jungwon University Research Grant (2021-033).

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.