결장암은 전 세계적으로 가장 흔한 악성 종양 중 하나로, 매년 수많은 환자가 진단받고 있으며, 사망 원인에서도 높은 비율을 차지하고 있다 ^(1,2). 결장암의 발생과 진행은 여러 유전적 요인과 환경적 요인, 특히 식습관 및 생활 방식에 의해 영향을 받는다. 이러한 복합적인 요인 속에서 p53 단백질의 역할이 특히 주목받고 있다 ^(1,2). P53은 세포 주기를 조절하고 DNA 손상을 수선하는 주요 종양 억제 단백질로, 세포의 생존과 사멸을 결정짓는 중요한 기능을 한다. P53 단백질의 변이는 결장암을 포함한 여러 종류의 암에서 빈번히 발견되며, 이는 암세포의 저항성과 밀접한 관계가 있다 ^(3,4). 따라서 p53의 기능을 복원하거나 활성화하는 전략은 결장암 치료에 중요한 접근법이 될 수 있다.

세포 주기는 세포가 성장하고 분열하는 과정으로, 이 과정에서의 조절은 암 발생에 큰 영향을 미친다. p53은 DNA 손상에 반응하여 G1/S 전이 및 G2/M 전이에서 세포 주기를 정지시키는 기능을 수행한다. 이러한 세포 주기 조절을 통해 p53은 손상된 DNA를 수선할 시간을 제공하거나, 수선이 불가능한 경우 세포 사멸을 유도하여 암세포의 발생을 억제한다 ⁽⁵⁾. 세포 사멸은 암 치료에서 중요한 과정으로, 다양한 단백질들이 이 과정에 관여한다. Bcl-계의 단백질은 세포 생존과 사멸을 조절하는 데 핵심적인 역할을 한다. Bcl-2는 세포 사멸을 억제하는 반면, Bax는 세포 사멸을 촉진하는 단백질이다. 이들 단백질의 균형은 세포의 운명을 결정짓는 중요한 요소로 작용한다 ⁽⁶⁾. 또한, Akt 경로는 세포 생존 신호를 전달하는 중요한 경로로, Bcl-2의 발현을 증가시키고, Bax의 활성화를 억제함으로써 세포 사멸을 억제하는 역할을 한다 ⁽⁷⁾.

Amifostine은 핵 방사선으로부터 군인을 보호하기 위해 개발된 화합물로 ^(8,9), 방사선 및 항암제의 부작용을 감소시키기 위해 병용 사용된다 ⁽⁸⁾. 그러나 amifostine의 작용 메커니즘에 대한 이해는 아직 부족하다. 최근 연구에 따르면, amifostine은 p53 의존적 경로를 통해 정상 조직을 선택적으로 보호하며, 이는 p53 단백질에 결합하고 하향 조절 유전자의 전사활성화를 향상시키는 것과 관련이 있는 것으로 보고되었다 ^(10,11).

C-Abl 단백질 타이로신 키나제는 DNA 손상에 대한 세포의 반응을 조절하며, p53과 상호작용하여 세포 주기를 조절하고 세포 사멸을 유도하는 역할을 한다 ⁽¹²⁾. 여러 연구에서 c-Abl의 활성화가 p53 의존적 경로를 통해 세포 주기 정지 및 사멸을 유도한다고 알려져 있다 ⁽¹³⁾. 이러한 c-Abl, p53, Bcl-2/Bax, Akt 간의 상호작용은 결장암 세포에서 amifostine의 효과를 이해하는 데 중요한 요소로 작용할 수 있다.

본 연구는 HCT116 결장암 세포주를 이용하여 amifostine이 c-Abl, p53, Bcl-2, Bax, Akt 간의 상호작용을 통해 세포 주기 및 세포 사멸에 미치는 영향을 조사하고자 한다. 이를 통해 결장암 치료 전략을 개선하고, 관련 단백질들의 역할에 대한 이해를 증진하는 데 기여할 것으로 기대된다.

1. 세포배양

결장암 세포주인 HCT116 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, CCL 247)에서 구매하여 사용하였다. HCT116p53–/– 세포주는 두 p53 대립유전자가 모두 결실된 세포이다 ⁽¹⁴⁾. c-Abl 결핍 마우스 섬유아세포 (3T3-Abl–/– 세포)와 재구성된 3T3-Abl+/– 는 Dr. JYJ Wang으로부터 제공받았다 ⁽¹⁵⁾. 3T3-mock 세포는 모든 실험에서 음성 대조군으로 사용되었다. 모든 세포주들은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (Irvine Scientific)에 100 mM L-glutamine과 10% 가열 불활성화 소태아 혈청을 추가하여 유지했다. 연구에 사용된 모든 HCT 116 세포주들은 Dr. Howell 연구실에서 제공된 세포 배양법으로 배양하여 사용하였다 ⁽¹⁶⁾.

2. 세포성장률 측정

다양한 농도의 amifostine을 24시간 동안 처리한 후 세포를 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척하였다. 새로운 배지 첨가 후 37°C의 온도와 5% CO₂를 유지하는 배양기에서 10–14일 동안 배양하였다. PBS로 세척 후 메탄올로 고정하여 0.1% crystal violet으로 염색하고, 50개 이상의 세포의 세포 클러스터는 콜로니로 개수를 세었다. 각 약물 농도에 대해 최소 3회 이상 수행하여 평균과 표준편차를 구하였다. 대수 선형 보간법(log-linear interpolation)을 이용하여 IC50 값을 계산하였다.

3T3 세포는 분리된 콜로니를 형성하지 않으므로, sulforhodamine B (SRB) 성장률 측정법을 사용했다. 섬유아세포는 96 well plates에 500 세포/웰의 밀도로 100 μL 용액에 배양했다. 24시간 후, 다양한 농도의 약물을 최종 부피 100 μL 용액에 추가하였으며, 약물 노출 시작 후 추가로 72시간 동안 세포를 성장시켰다. 세포 성장을 멈추기 위해 50 μL의 50% (w/v) 삼클로로아세트산(trichloloro aceticacid)을 추가하였고, 세포를 SRB (Sigma Chemical Co.)로 염색하여 분광광도계로 측정했다 ⁽¹⁷⁾. 각 실험은 3회이상 수행하여, 평균과 표준편차를 구하였고, 대수 선형 보간법(log-linear interpolation)을 이용하여 IC50 값을 계산하였다.

3. 세포주기 측정(cell cycle analysis)

1 × 10⁶–2 × 10⁶ 세포에 0, 0.1, 1 및 5 mM 농도의 amifostine을 24시간 동안 처리한 후, 세포를 차가운 PBS로 3회 세척하고, 차가운 에탄올(100%)에 고정하였다. 10⁶개 세포를 원심분리하고, 냉장 보관한 PBS 500 μL를 넣어 섞어준 후 0.1 mg/mL RNAse A (Sigma Chemical Co.)로 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. Propidium iodide (PI, Molecular Probes)을 50 mg/mL 농도로 세포 현탁액에 첨가했다. 4℃에서 30분 동안 보관한 후, FACScan 유세포 분석기(Becton-Dickinson)를 사용하여 세포를 분석했다. 세포 주기의 각 단계에서 세포 비율은 Multicycle AV Cell Cycle 소프트웨어(Phoenix Flow Systems)를 사용하였다 ⁽¹¹⁾.

4. 세포사멸 측정(apoptosis analysis)

세포사멸 비율을 측정하기 위해 세포에 5 mM 농도의 amifostine을 24, 48, 72 시간 동안 처리한 후, 세포를 채취하여 원심분리하고 100 μL PBS에 재 현탁하고 acridine orange와 ethidium bromide로 염색하였다. 염색 후, 세포는 형광 현미경에 의해 세포 사멸 형태를 평가하였다. 세포는 형태학적 기준 ⁽¹⁸⁾에 따라 세포사멸로 점수를 매겼다.

5. DNA 손상 측정(r-H2AX 측정)

DNA 손상 유무를 확인하기 위해 세포를 5 mM amifostine이 포함된 배양 배지에서 유리 챔버 슬라이드 위에서 24, 48시간 동안 배양하였다. 이후, 세포는 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, 고정된 세포는 항체가 세포 내부로 침투할 수 있도록 0.5% 트리톤 X-100으로 투과화 하였다. 다음으로, PBS에 10% 염소 혈청(bovine serum albumin)을 사용하여 비특이적 결합을 차단하였다. 차단 세포는 PBS와 0.1% 트리톤 X-100으로 세척한 후, 인산화된 H2AX (γ-H2AX) 를 검출하기 위해 monoclonal anti-γ-H2AX antibody (Upstate, ref. 05-636)를 1차항체로 사용하였다. 항체는 1:500 농도로 희석하여 세포에 처리하고 4°C에서 반응시켰다. 2차 항체는 FITC-conjugated secondary antibody (Dako, F0205)를 사용하여 실온에서 1시간 반응 시킨 후 PBS로 세척하였다. DAPI (4′-6-diamidino-2-phenylindole)는 세포핵의 DNA와 결합하여 파란색 형광을 발산한다. DAPI는 1:1,000으로 희석하여 세포에 처리하였다. DAPI로 염색한 후, PBS로 세척하였다. Vectashield (Vector)를 사용하여 형광염색된 샘플을 장착하였으며, LSM 510 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 이미지 분석 소프트웨어(Carl Zeiss MicroImaging)를 사용하여 이미지를 캡처하고 분석하였다. 정량적 분석을 위해 샘플당 최소 50개의 세포가 분석되었다.

6. Western blot analysis

세포의 증식과 세포주기 조절 및 세포사멸에 관여하는 단백질의 발현을 조사하기 위해 세포를 6 well plates에 2 × 10⁴개의 세포를 배양한 후, amifostine 1 mM과 5 mM 농도로 24시간 처리하였다. 그 후 RIPA buffer로 단백질을 분리한 후, 30 μg의 단백질을 전기 영동하였다. p21^CIP1/WAF1 (AB-6, # OP79, Delta Biolabs), p53 (FL-393, # sc-6243, Santa Cruz Biotechnology), Akt, 인산화된 Akt (Cell Signaling), anti-c-Abl mouse monoclonal antibody (8E9, #554148, BD Pharmingen), Bax (Cell Signaling), Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology)와 anti-β-actin (AC15, # A5441,1:2000, Sigma-Aldrich)는 1차항체를 1:1,000의 비율로 하여 반응시키고 각 매뉴얼에 따라 희석하여 사용했다. 이차 항체는 1:2,000으로 희석하며 1차항체에 맞게 사용하여 한 시간 반응 후 ECL 반응으로 X-ray 필름을 덮고 반응시킨 후 현상했다.

7. 통계처리

모든 실험들은 세 번 이상 반복 진행하였으며, 이에 대한 결과는 평균 ± 표준편차로 계산하였다. Amifostine 미처리 군(대조군)과 amifostine 농도별 및 시간에 따른 변화의 유의성은 two sided t-test 방법을 이용하였다. 각 분석의 통계적 유의수준은 95% 신뢰수준(P-value < 0.05)으로 검증하였다.

1. Amifostine이 세포증식에 미치는 영향

Amifostine에 대한 세포의 감수성을 평가하기 위해 다양한 세포주에서 IC50 값을 측정하였다(Table 1). C-Abl+/– 세포주는 c-Abl–/– 세포주보다 약물에 대해 더 민감한 것으로 나타났다. 24시간 노출 시 c-Abl 결핍 세포에서의 IC50 값이 유의미하게 높았다(P < 0.00001). 72시간 노출에서도 동일한 경향이 관찰되었다 (P < 0.025). 이는 c-Abl 단백질의 존재가 약물의 효능에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 의미한다. P53 단백질이 존재하는 세포주(HCT116p53+/+)는 p53 결핍 세포주(HCT116p53–/–)에 비해 amifostine에 대해 높은 IC50 값을 보였으며(P < 0.002), 이는 p53 결핍이 약물 감수성을 증가시킨다는 것을 시사한다(Fig. 1). 72시간 노출 시에도 비슷한 경향이 나타났다(P < 0.05). P21 단백질이 존재하는 세포주(HCT116p21+/+)는 p21 결핍 세포주(HCT116p21–/–)에 비해 amifostine에 대해 높은 IC50 값을 보였으며(P < 0.005), 이는 p21 결핍이 약물 감수성을 증가시킨다는 것을 시사한다(Table 1). 반면, 72시간 노출 시에는 p21 단백질의 결핍은 amifostine 감수성에 유의미한 영향을 미치지 않았다(P = 0.22).

Table 1

Cell sensitivity by amifostine

Cell line	Exposure time (h)	IC50 (mM)	P-value
C-Abl+/–	24	4.4
C-Abl–/–	24	6.8	0.00001
C-Abl+/–	72	3.0
C-Abl–/–	72	4.1	0.025
HCT116p53+/+	24	5.0
HCT116p53–/–	24	2.4	0.002
HCT116p53+/+	72	1.6
HCT116p53–/–	72	1.0	0.05
HCT116p21+/+	24	5.2
HCT116p21–/–	24	2.8	0.005
HCT116p21+/+	72	1.2
HCT116p21–/–	72	1.0	0.22

All cells were treated with various concentration of amifostine for 24 and 72 hours and IC50 values were generated by clongenic assay and sulforhodamine B assay. Each data value represents the mean of three independent experiments performed with triplicate culture.

Fig. 1. Effect of p53 on amifostine sensitivity. HCT116 cells were exposed for 24 hours, and dose–response curves were generated by clonogenic assay. Each data point represents the mean of at least 3 independent experiments performed with triplicate culture. *P < 0.05 and **P < 0.005 compared to the amifostine concentration 0.

이 결과는 c-Abl, p53과 p21 단백질이 amifostine에 대한 세포 감수성에 중요한 역할을 하며, c-Abl 결핍 세포는 저항성을 보이는 반면, p53과 p21 결핍 세포는 오히려 더 높은 감수성을 나타낸다는 것을 시사한다.

2. Amifostine이 세포주기에 미치는 영향

Amifostine의 항증식 활성을 평가하기 위해 다양한 농도의 amifostine으로 처리한 HCT116 세포의 세포 주기 분포를 분석하였다. 유세포 분석 결과, amifostine이 24시간 동안 처리될 때 HCT116 세포에서 G2/M 단계 정지를 유도하는 것으로 나타났다(Fig. 2A). G2/M 단계 정지는 1 mM 농도에서 최대치를 보였으며, amifostine을 처리하지 않은 세포주기와 비교하였을 때 통계학적으로 유의미한 차이를 나타내었다(Fig. 2B). 이러한 결과는 G2/M 단계에서의 세포 주기 정지가 amifostine의 항증식 효과에 기여할 수 있음을 나타낸다. HCT116p53+/+ 세포에서 HCT116p53–/– 세포 보다 더 높은 비율로 G2/M 단계에서의 세포 주기 정지가 관찰되었다(Fig. 2B).

Fig. 2. (A) Effect of amifostine-induced cell cycle arrest. HCT116 sublines were exposed to amifostine for 24 hours. The percent of cells in G2/M, S and G1 phase was determines by flowcytometery. Data points represent mean of 3 different experiments. (B) Distribution of G2/M phase after treatment with various concentrations of amifostine. Each data point represents the mean of at least 3 independent experiments performed with triplicate culture. *P < 0.05 and **P < 0.005 compared to the amifostine concentration 0.

3. Amifostine에 의한 DNA 손상

Amifostine이 유도한 G2 정지가 DNA 손상에 기인하는지 확인하기 위해, amifostine 처리된 HCT116 세포를 DNA 손상의 마커인 r-H2AX에 대한 항체로 염색하여 면역형광법을 통해 확인하였다(Fig. 3A). r-H2AX가 존재하는 세포의 비율을 측정하여, DNA 손상 정도를 평가하였다(Fig. 3B). 세포 핵을 염색하기 위해 DAPI로 반대 염색하였으며, DAPI는 세포핵이 파란색으로 염색되어 세포의 위치와 구조를 확인할 수 있다. 5.0 mM 농도의 amifostine으로 24시간 처리한 결과, r-H2AX가 염색된 세포 모양이 관찰되었고(Fig. 3A), 48시간 처리 후 차이가 더 커졌으며, 두 세포주를 비교 하였을 때, HCT116p53–/– 세포에서 r-H2AX 양성 세포가 더 많이 증가하는 경향을 보였으며(Fig. 3B) 통계적으로 유의미한 차이를 나타내었다. HCT116p53+/+ 세포보다 더 높은 비율로 DNA 손상이 일어나고 있다는 것을 의미한다.

Fig. 3. (A) Amifostine induces the arrest of HCT116 cells in mitotic metaphase-like state. Cells were treated with 5.0 mM amifostine for 24 hours and then stained with antibodies against. The presence of phosphorylated H2AX histone (γ-H2AX) was detected by immunofluorescence. The cells were counterstained with DAPI to stain nuclei and the fraction of positive cells is indicated in each case. Representative images are shown. (B) For counting purposes, at least 50 nuclei were analyzed per sample. Each data point represents the mean of at least 3 independent experiments performed with triplicate culture. *P < 0.05 and **P < 0.005 compared to the the control.

4. Amifostine이 세포사멸에 미치는 영향

p53 단백질의 존재 여부가 amifostine에 의한 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위해 acridine orange와 ethidium bromide로 염색방법을 사용하여 HCT116p53+/+와 HCT116p53–/–를 비교하여 Table 2에 나타내었다. 5 mM 농도의 Amifostine을 24시간 처리 시 HCT116p53+/+의 세포사멸 비율이 1.43, HCT116p53–/–는 2.18로, p53이 결핍된 세포에서 세포사멸 비율이 더 높게 나타났다(P < 0.005). 두 세포주간의 세포 사멸 비율을 비교했을 때 24시간 처리는 p53 결핍 세포가 1.52배 높은 세포사멸 비율을 보였고, 48시간과 72시간에서는 각각 1.44배, 1.27배로 감소하는 경향을 보였다. 즉 p53 이 결핍된 HCT116 세포는 amifostine에 의해 유도된 세포사멸이 더 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 p53이 세포사멸 경로에서 중요한 억제인자로 작용함을 보여주는 결과로 생각된다.

Table 2

Effect of p53 on amifostine-induced apoptosis

Time (h)	HCT116p53+/+	HCT116p53–/–	Fold	P-value
24	1.43	2.18	1.52	0.002
48	2.86	4.13	1.44	0.001
72	3.31	4.2	1.27	0.005

HCT 116 sublines were exposed to 5.0 mM concentrations amifostine for 24 hours, 48 and 72 hours. Ratio of the apoptosis value in the functionally deficient to proficient cells determined from acridine orange and ethidium bromide and this value was compared untreated with amifostine treated cells. Data points represent mean of 3 different experiments.

5. 세포증식과 세포사멸 관련 단백질 분석

Amifostine에 의해 유발된 세포사멸 및 세포 주기 진행에 대한 p53 단백의 관련성을 알아보기 위해 세포증식과 세포사멸 관련 단백질의 발현을 조사하였다. 1.0과 5.0 mM 농도의 amifostine에 24시간 노출 시, HCT116p53+/+ 세포의 경우 p53 단백질의 발현이 관찰되었으며, p21 단백질의 발현이 24시간 처리부터 증가되어 관찰되었다. 반면, HCT116p53–/– 세포의 경우 p21 단백질의 발현이 약하게 관찰되었다(Fig. 4). Bcl-2와 Bax의 균형은 세포의 생존과 사멸을 결정짓는 중요한 요소이다. HCT116p53+/+ 세포의 경우, Bcl-2의 발현이 HCT116p53–/– 세포보다 우세하게 일어나는 반면, Bcl-2의 발현은 1 mM보다 5 mM 농도에서 발현이 약간 감소되는 경향을 보였다. Bax의 발현은 두세포주 모두 1 mM보다 5 mM 농도에서 발현이 증가되는 경향을 보였다. Bcl2/Bax의 비율은 HCT116p53–/– 세포보다 HCT116p53+/+ 세포에서 2배 이상 높게 측정되었다. 두 세포주 모두 인산화된 AKT와 c-Abl이 발현되었으며 1 mM보다 5 mM 농도에서 유의미한 발현의 감소를 보였다(P < 0.05).

Fig. 4. Effect of amifostine on the expression of cell cycle and apoptosis related proteins. Cellular proteins were analysed by Western blotting at 24 hours after the beginning of exposure to 1 and 5 mM amifostine concentrations. The images are representative of 3 independent experiments (left), the protein levels were quantified by Image densitometry software (right) and are expressed as the mean ± standard deviation, of 3 independent experiments, relative to untreated control after normalizing to actin. *P < 0.05.

본 연구는 amifostine이 HCT116 결장암에서 p53 단백질의 중요한 역할을 통해 세포 증식 억제 및 세포 사멸 유도에 미치는 영향을 규명하고자 하였다. 연구 결과, amifostine의 세포 민감도는 p53의 유무에 따라 크게 달라졌으며, 이는 p53이 세포의 스트레스 반응과 약물 저항성에서 중요한 역할을 한다는 사실을 시사한다. 특히, c-Abl 단백질이 amifostine의 효능에 미치는 긍정적인 영향도 중요한 발견으로, c-Abl의 활성화가 세포의 약물 반응성을 증대시킬 수 있다는 가능성을 제시하였다.

G2/M 단계에서의 세포 주기 정지는 amifostine의 항증식 효과와 밀접하게 관련되어 있으며 ⁽⁵⁾, 이는 종양 세포의 성장과 전이를 억제하는 데 중요한 메커니즘으로 작용할 수 있다. Amifostine은 다양한 종양세포에서 G2/M 단계에서 세포 주기 정지를 유도하는 것으로 보고되었고 ⁽⁵⁾, p53과 p21 또는 GADD153의 발현 증가가 세포 주기 정지에 관여한다고 알려져 있다 ⁽⁷⁾. 본 연구에서 amifostine은 세포 생존율을 감소시키고, G2/M 단계에서 세포 주기 정지가 유도되었으며, 이는 DNA 손상과 관련된 결과로 생각된다. 유세포 분석과 면역 염색 결과, amifostine 처리로 핵 내 r-H2AX의 축적이 확인되었으며, 이는 이중가닥 DNA 손상이 유도되었다. 이로 인해 세포는 G2 및 M 단계에서 세포 주기를 정지시키는 반응을 보였다. DNA 손상에 대한 세포 반응에서 c-Abl은 세포 주기 정지 세포 사멸 사이의 선택을 조절하는 중요한 역할을 하며, p53과 p21의 발현을 통해 이러한 선택에 영향을 미친다고 보고되었다 ⁽¹⁹⁾. DNA 손상에 대한 세포 반응으로 DNA 손상이 회복 불가능할 때, 세포는 세포 주기 정지 또는 유도되며 세포 사멸 경로를 선택한다. Udden 등 ⁽¹⁹⁾은 연구에서 STI571이라는 c-Abl 키나아제 억제제를 사용하여 c-Abl을 억제했을 때, p21의 발현이 억제되었고, 이는 세포 주기 정지와 세포 노화의 억제를 의미한다고 보고 하였다. 반면에, c-Abl이 억제되면 세포가 세포 사멸을 더 잘 유도할 수 있다는 것을 발견했다. 즉, p21의 억제가 세포 사멸 억제 효과를 제거하여 세포가 더 쉽게 세포 사멸을 진행하게 된다. 세포 주기 정지는 DNA 손상에 의한 스트레스 반응으로 발생하며, 이는 p53-p21 경로와 밀접하게 연관되어 있다. c-Abl은 G2 체크포인트에서 중요한 역할을 하며, c-Abl이 없으면 G2에서의 주기 정지가 제대로 이루어지지 않아서 세포가 G1 및 S 단계로 진행할 수 있게 된다. p21은 p53의 주요 전사적 표적이며, c-Abl은 p53의 활성화 상태에 영향을 미친다. 또한, c-Abl은 p53-의존적인 방식으로 p21을 유도할 수 있지만, 키나아제 활성 없이도 p21 유도를 할 수 있다는 연구 결과도 있다 ⁽⁵⁾. 반면에, 높은 농도의 ADR (DNA 손상유도제)은 세포 사멸을 유도한다 ⁽¹⁹⁾. 이 과정은 p21의 발현에 의해 억제될 수 있기 때문에, p53 의존적인 p21 유도가 세포 자살을 억제하는 역할을 한다. 하지만 STI571 (티로신 키나제)을 함께 처리하면 p21의 발현이 감소하고, 그로 인해 세포 자살이 촉진된다고 보고하였다 ⁽¹⁹⁾. 즉 DNA 손상에 대한 세포 반응에서 c-Abl은 세포 주기 정지와 세포 사멸 간의 선택을 조절하는 중요한 역할을 한다. 연구에 따르면, c-Abl은 DNA 손상이 회복 불가능할 경우 세포가 세포 주기 정지 또는 세포 사멸 경로를 선택하도록 영향을 미친다. 특히, c-Abl이 활성화되면 p53과 p21의 발현이 증가하고, 이는 세포가 세포 주기 정지를 유도하도록 한다. 반대로, c-Abl이 억제되면 세포는 세포 주기 정지 대신 세포 사멸 경로를 더 쉽게 선택하게 된다.

C-Abl은 p53과 협력하여 Bax의 발현을 유도하고, Bcl-2의 발현을 억제하여 세포 사멸을 유도한다 ⁽¹²⁾. P53은 c-Abl의 활성화를 통해 세포 주기를 정지시키고, Bax의 발현을 촉진하여 세포 사멸을 강화한다. Akt는 Bcl-2를 활성화하여 세포의 생존을 돕고, Bax의 사멸 신호를 억제하는 역할을 함으로써 이들 단백질 간의 균형은 세포의 생존과 사멸을 결정짓는 중요한 요소로 알려져 있다 ^(20,21).

본 연구 결과, amifostine 처리 후 HCT116 세포주에서 G2/M 단계의 정지가 유도되었으며, 이는 p53 단백질과 관련되었고, DNA 손상 신호와 밀접한 관련이 있음을 알 수 있었다 ^(22,23). Amifostine이 처리된 HCT116 세포에서 c-Abl이 활성화되면서 p53을 통한 p21과 Bax의 발현이 증가하고, Bcl-2의 발현이 억제되어 세포 사멸을 유도함을 확인했다. 이러한 c-Abl의 활성화는 p53과 협력하여 세포 주기 정지와 세포 사멸을 조절하는 중요한 메커니즘으로 작용한다고 생각된다.

DNA 손상의 증가가 세포 사멸을 촉진하는 경로는 다양한 암 치료에서 중요한 타겟으로 여겨지며, 이러한 기전을 통한 amifostine의 작용은 추가적인 연구의 필요성을 시사한다. 특히, p53 단백질이 결실된 HCT116 세포에서 세포 사멸률이 증가한 점은 c-Abl, Akt, p53이 세포 생존 신호를 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 강조한다. Bcl-2와 Bax 단백질의 균형 또한 세포의 생존과 사멸에 결정적인 영향을 미치며, 이 균형을 통해 amifostine의 작용이 조절될 가능성이 있다. HCT116p53–/– 세포의 경우 p53과 무관하게 Akt에 의해 Bcl-2를 활성화하여 세포의 생존을 돕고, Bax의 사멸 신호를 억제하는 역할을 함으로써 이들 단백질 간의 균형은 세포의 생존과 사멸을 결정짓는 것으로 생각이 된다. Akt 경로의 활성화와 같은 다른 세포 신호전달 경로와의 상호작용 또한 추가적인 연구가 요구된다. 본 연구의 한계로는 HCT116 세포주에 대한 결과가 다른 유형의 결장암 세포 또는 다양한 암세포에 일반화될 수 있는지에 대한 검증이 필요하다는 점이다. 또한, amifostine의 작용 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 위해 추가적인 분자생물학적 연구가 필요하다. 향후 연구에서는 p53 및 c-Abl 단백질의 역할을 보다 정밀하게 분석하고, amifostine의 다양한 농도에서의 반응을 다각적으로 평가하는 것이 중요하다. 결론적으로, 본 연구는 amifostine의 항암 작용에 대한 이해를 증진시키며, p53 단백질이 이 과정에서 중요한 조절 인자임을 규명하였다. 이러한 결과는 향후 amifostine의 효과적인 암 치료 전략 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

None.

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None.

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