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Abstract안구건조증(dry eye syndrome)은 안과를 찾는 가장 흔한 질환 중 하나로, 2017년 국제연구학회(Tear Film and Ocular Surface Society Dry Eye Workshop)에 따르면 안구건조증은 “눈물막 항상성 부족을 특징으로 하는 안구 표면의 다인자성 질환으로, 불안정한 눈물막과 높은 삼투압, 안구 표면 염증 및 손상, 신경 감각의 이상이 원인”으로 정의하였다 (1). 흔히 내인성 원인(노화, 류마티스성 관절염, 쇼그렌 증후군, 갑상선 질환 약물 복용 등)으로 인해 안구건조증이 동반되기도 하지만, 현대인들의 경우 스마트폰, 태블릿과 같은 디지털 기기의 사용, 장시간 컴퓨터 작업, 황사와 같은 대기오염 등과 같이 건조한 안구 환경 형성으로 인한 안구건조증 발생이 더욱 증가하고 있다 (2). 안구건조증의 대표적인 증상으로는 안구의 자극감, 이물감, 작열감, 눈부심, 피로감 등이 있으며, 이러한 증상들은 일상생활에서 불편함을 초래하고, 전반적인 삶의 질을 저하시킬 수 있다 (3). 특히, 안구 표면에 염증이 수반되는 염증성 안구건조증의 경우 적절한 치료를 받지 못하고 방치하게 될 시 각막 손상과 더불어 영구적인 시력 상실 또한 발생할 수 있다 (4).
현재 안과에서 시행하고 있는 안구건조증 진단 방법으로는 세극등 현미경 검사, 눈물 분비량을 측정하는 쉬르머 검사(Schirmer test), 눈물막 파괴시간 검사(tear break-up time, TBUT), 안구 표면 손상을 파악하기 위한 검사, 마이봄샘의 형태를 관찰하는 마이봄샘 검사 등을 시행하여 진단하게 된다. 그러나 이러한 진단 방법은 눈물막의 안정성이나 안구 표면의 손상도를 파악하는 데 초점을 맞추고 있어, 안구 표면의 염증 상태를 진단하는 데에는 한계가 있다 (5-8).
염증성 안구건조증은 눈물막의 불안정성으로 인해 안구 표면이 건조해지고, 이로 인해 안구 표면의 염증 반응이 유발되어 발생하는 질환이다. 이 과정에서 안구 표면의 상피세포와 면역세포는 인터루킨-1β (interleukin-1β, IL-1β), IL-6, 종양괴사인자-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 등의 다양한 염증성 사이토카인을 분비하게 된다. 이러한 염증성 사이토카인들은 조직 손상 후 세포 외 기질의 재생에 관여하는 metalloproteinase-9 (MMP-9)의 발현을 촉진하며, MMP-9이 증가할 경우 안구 표면의 상피 장벽을 손상시켜 눈물막의 안정성을 더욱 악화시키고, 결과적으로 염증을 악화시키는 악순환을 초래한다 (9-11).
안구 표면에서 MMP-9의 증가는 염증의 존재와 심각도를 반영하며, 이로 인해 눈물 내 MMP-9의 농도를 측정하는 것이 염증성 안구건조증을 진단하는 데 중요한 바이오마커로 활용될 수 있다 (12). 따라서 본 연구에서는 현재 임상에서 시행되고 있는 안구건조증 진단 방법과 함께, MMP-9을 타겟으로 한 형광 면역 기반 정량검사 시스템을 개발하여 염증성 안구건조증을 보다 정확하게 진단하고자 한다. 이를 통해 비염증성과 염증성 안구건조증을 구분하고, 염증의 정도에 따른 적절한 치료가 가능하게 하여, 향후 안구건조증 관리에 있어 중요한 역할을 할 수 있는 진단 도구의 개발을 목표로 한다.
염증성 안구건조증의 표적 단백질인 MMP-9 항체는 MM06, R043 (Sino Biological)를 사용하였으며, control 항체로는 goat anti-rabbit IgG (Thermo Fisher Scientific)을 사용하였다. Lateral flow assay (LFA) 스트립 제조를 위해 흡수패드(17 CHR chromatography grade; Whatman), NC membrane (PW-90; Polywick Co., Ltd.), 샘플 패드와 중합 패드(Polyester fiber membrane grade 6613; Ahlstrom)를 사용하였으며, 샘플 패드, 중합 패드의 경우 polyvinyl alcohol (PVA; Sigma-Aldrich)로 전처리 후 사용하였다. 형광 중합의 경우 Alexa Fluor 647 NHS ester와 Zeba spin desalting column은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하여 사용하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO), Tween 20, casein, bovine serum albumin (BSA)은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.
MMP-9 항체와 형광 염료 접합체 제작을 위해 형광 염료는 Alexa Fluor 647 NHS ester를 사용하였으며, DMSO에 10 mg/mL 농도로 용해하여 사용하였다. MMP-9 항체는 1 mg/mL 농도로 사용하였고, MMP-9 항체와 Alexa Fluor 647 NHS ester는 몰 농도비가 1:10 비율이 되도록 제조하여 실온에서 1시간 반응하였다. 이후 Zeba spin desalting column을 사용하여 반응하지 않은 free 물질을 제거하고 4℃에 보관하여 사용하였다.
MMP-9 정량 진단 키트는 LFA 기반 형광 면역 분석 시스템을 적용하였으며, 분석용 스트립의 경우 샘플 패드, 중합 패드, NC membrane, 흡수 패드로 구성된다. 샘플 패드와 중합 패드는 각각 4 × 14 mm, 4 × 10 mm 크기로 PVA에 전 처리한 polyester fiber 재질의 grade 6613 pad를 사용하였으며, 중합 패드에는 형광 신호체가 중합되어 있는 detection 항체를 antibody dilution buffer인 1% BSA/10 mM phosphate-buffered saline (PBS)을 사용하여 10 μg/mL이 되도록 희석 후 37℃에서 밤새 건조 후 사용하였다. NC membrane은 4 × 20 mm의 크기이며, control과 test line에는 각각 mouse anti-rabbit IgG, MMP-9 항체를 0.5 mg/mL의 농도가 되도록 PBS (pH 7.4)로 희석하여 spot 형태로 0.5 μL 분주 또는 reagent dispenser를 사용하여 line 형태로 분주한 뒤 37℃에서 overnight 건조 후 사용하였다. 흡수 패드는 4 × 15 mm의 크기의 17 CHR을 사용하였으며, 각 구성 요소들은 분석 시 원활한 flow를 위해 backing card에 서로 약 1 mm 정도 겹치도록 부착하여 조립하였다. 표준물질의 경우 sample dilution buffer인 0.5% BSA_0.25% Casein_1% Tween 20/10 mM PBS를 사용하여 분석하고자 하는 농도로 희석하여 분석에 사용하였으며, 눈물 샘플 또는 인공눈물의 경우 sample dilution buffer로 10분의 1배 희석 후 사용하였다. 이후 분석으로는 제조한 스트립을 전용 카트리지에 넣고, 표준물질 또는 샘플을 100 μL씩 넣어준 뒤, 20분간 반응이 되도록 두었다. 20분 반응 후 형광 신호 측정의 경우 형광 리더기를 통해 측정하였으며, 신호 변환 프로그램을 통해 형광 신호를 도식화하여 결과를 분석하였다.
형광 신호 측정은 여기 광원으로 레이저를 사용하는 현장용 형광측정기를 사용하였다. 형광 리더기 내 레이저 빛에 의해 시료 속 형광 물질이 여기 되어 광신호를 발생시키고, 이를 광 검출기가 감지하여 전기적 신호로 변환한다 (13). 광 검출기를 통해 변환된 전기적 형광 신호는 연결된 변환 프로그램(VBTERM; Informer Technologies, Inc.)으로 전달되어 그래프 형태로 제공되었다. 형광 증폭비는 형광 신호가 증폭되는 전압을 의미하며, 신호 측정 시 증폭비는 15로 설정하였다.
분석적 성능 시험에서 limit of detection (LOD)과 limit of quantitation (LOQ), 재현성을 평가하기 위해 다음과 같은 계산 방법을 사용하였다. 농도가 0일 때의 background 신호들의 표준편차(standard deviation, SD)와 구축한 standard curve의 기울기(slope)를 활용하여 LOD와 LOQ를 구했으며, LOD의 경우 LOD = 3.3 × (SD of blank)/slope, LOQ의 경우 LOQ = 10 × (SD of blank)/slope 계산식을 사용하여 산출하였다 (14). 재현성 평가는 반복 측정, intra-day, inter-day 분석 후 변동 계수(coefficient of variation, CV)를 활용하여 평가하였으며, CV (%)는 표준편차/평균 × 100 계산식을 사용하여 산출하였다.
눈물 샘플에서 염증성 안구건조증 표적 단백질인 MMP-9 농도를 정량 분석하기 위해 LFA 기반 형광 면역 분석법을 사용하였다. 분석은 LFA 방식의 면역 스트립을 사용하였으며, 원리 및 결과 확인은 Fig. 1과 같이 진행하였다.
Fig. 1. Principles of analysis and fluorescence signal measurement in lateral flow assay (LFA)-based fluorescence immunoassays. (A) The assembly type of strips for LFA-based analysis, (B) the principles of strip analysis and reaction mechanisms, and (C) the method for analyzing the fluorescence signal results after the reaction. After the fluorescence immunoassay, the fluorescence signal of the detection antibody is detected through a detector, and then the results are analyzed by converting them into a graph for further analysis.
Fig. 1A의 경우 LFA 기반 fluorescence immunoassay 스트립의 구성을 나타내며, 스트립 하단부터 샘플 패드, 중합 패드, 샘플 패드, NC membrane, 흡수 패드 순서로 위치 시켜 원활한 면역 반응이 일어날 수 있도록 하였다. 스트립의 conjugate pad에는 detection antibody-Alexa conjugate 결합체가 건조되어 있으며, NC membrane에는 capture antibody와 control antibody를 미리 고정하였다.
스트립에서의 면역 분석은 Fig. 1B와 같이 샘플 용액에 MMP-9 단백질이 존재할 경우, MMP-9 단백질은 sample pad를 따라 서서히 이동하여 conjugate pad에 건조되어 있는 detection antibody-Alexa conjugate와 만나 1차 면역반응을 형성한다. 이후 MMP-9과 detection antibody-Alexa conjugate 결합체는 NC membrane의 test line에 고정되어 있는 capture 항체와 반응하여 sandwich 형태의 면역 복합체를 형성하게 되고, MMP-9과 결합하지 않은 detection antibody-Alexa conjugate는 control line에 고정되어 있는 control 항체와 반응하게 된다. 이후 반응에 참여하지 않은 물질들은 흡수 패드로 이동한다.
반응이 완료된 분석 스트립은 전용 카트리지에 조립 후 형광 리더기를 통해 형광 신호를 확인한다. Fig. 1C와 같이 눈물 샘플 속 MMP-9 양에 따라 test line에 형광 peak 신호가 다르게 나타난다. Control line의 신호의 경우 test line의 신호와는 별개로 항상 같은 형광 신호가 나타나야 하며, control line의 일정한 신호는 해당 분석이 제대로 이루어졌음을 의미한다. Control line에 신호가 나타나지 않은 경우는 분석의 오류로 분류하여 재분석을 진행해야 한다. 이렇게 형광 리더기를 통해 얻은 형광 신호는 peak 값을 수치로 계산하여 직선 형태의 그래프로 변환시킨 뒤 결과를 분석한다.
염증성 안구건조증 표적 단백질인 MMP-9과 민감하게 반응하는 최적의 항체 쌍을 선별하기 위해 MMP-9 항체를 조합하여 pair test를 진행하였다. 최적 항체 쌍은 비특이 신호가 나타나지 않으며, MMP-9 단백질과의 반응성이 높은 조합의 항체 쌍을 최종 선정하였다.
항체 쌍 선정 후에는 항체 고정 효율이 높으며, 고감도의 민감한 분석이 가능하도록 최적 NC membrane과 sample pad를 선정하는 실험을 진행하였다. NC membrane의 경우 스펙과 제조사가 다른 두 제품의 MMP-9 농도별 형광 신호와 background 신호 대비 특이 신호의 비(signal to noise ratio, SNR)를 동시에 비교하였으며(Fig. 2A), NC membrane을 제외한 다른 조건은 모두 동일하게 하여 실험을 진행하였다. 그 결과 MMP-9 농도 20 ng/mL와 50 ng/mL에서 NC #1의 경우 NC #2에 비해 형광 신호는 낮지만, SNR이 상대적으로 높은 비율을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 NC #1과 NC #2의 pore size의 차이로 pore size가 작은 NC #2의 경우 flow 속도가 느려 특이 신호가 증가하는 경향을 보였지만, background 신호가 같이 증가하였기 때문에 SNR은 낮은 비율을 나타냈다. 반면, pore size가 큰 NC #1은 flow 속도가 NC #2보다 빨라 특이 신호가 증가하는 경향은 나타나지 않았지만, background 신호가 없거나 낮게 나타나 SNR이 약 3.3배 높게 나타났다. 이를 통해 분석 시 NC #1을 사용하였을 때 background 신호 대비 특이 신호의 민감한 분석이 가능하고, 감도 면에서 더 적합한 NC membrane임을 확인하였다.
Fig. 2. Optimization of conditions for the metalloproteinase-9 (MMP-9) analysis system. (A) NC membrane effect. The ratio of specific signal to background signal was compared simultaneously with the fluorescence signals at different MMP-9 concentrations. In the case of NC #1, although the fluorescence signal was not high, the signal-to-noise ratio was approximately 3.3 times higher than that of NC #2. (B) Sample pad effect. Sample pad #1 is made of glass fiber, while sample pad #2 is made of polyester fiber. The sample pad made of polyester fiber exhibited a signal-to-noise ratio approximately 1.4 times higher. (C) Polyvinyl alcohol (PVA) treatment concentration. The fluorescence signals for polyester fiber at different PVA concentrations were examined. It was found that at lower PVA concentrations, the emission rate decreased, affecting the analysis. Treatment with 0.05% PVA improved the sensitivity.
또한 sample pad의 경우 같은 제조사에서 생산한 다른 재질의 두 제품을 MMP-9 농도별 SNR로 비교하였다(Fig. 2B). 그 결과 glass fiber 재질의 sample pad #1보다 PVA 처리한 polyester fiber 재질의 sample pad #2에서 MMP-9 농도별 SNR 비율이 약 1.4배 높게 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해 분석 시 sample pad #2를 사용하였을 때 감도 면에서 더 적합한 sample pad임을 확인하였다.
이어서 polyester fiber 재질의 sample pad를 분석에 사용 시 PVA 전처리 농도에 따른 형광 신호 비교를 위해 실험을 진행하였다. 이는 흡습성이 없는 polyester fiber 재질의 sample pad를 PVA로 전처리하여 친수성을 가질 수 있도록 하기 위함으로, PVA 농도에 따른 감도의 영향을 형광 신호로 비교하였다(Fig. 2C). 그 결과 PVA 0.05%로 전처리하였을 때, 비특이 신호 대비 특이 신호가 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다. PVA 농도가 너무 낮으면 sample pad의 표면의 친수성이 부족해 방출 속도가 떨어져 형광 신호가 낮아지고, 반대로 PVA 농도가 너무 높으면 비특이 신호가 증가하는 경향을 나타냈다. 따라서, PVA 0.05%로 전처리하였을 때 형광 신호의 감도 면에서 가장 효과적인 결과를 제공하는 것을 확인하였다.
MMP-9 분석 시스템을 사용하여 정량 분석을 하기 위해 standard curve를 구축하였다(Fig. 3). 분석 시스템의 재현성과 결과값의 일관성을 확보하기 위해 동일한 환경과 조건에서 MMP-9 농도 7구간을 3회 이상 반복 실험하였고, 이를 통해 얻은 결과들의 평균값을 활용하여 standard curve를 구축하였다. 구축한 standard curve는 MMP-9 각 농도 구간에서 측정된 형광 신호와 MMP-9 농도 간의 선형(linear) 관계를 보였으며, 높은 상관관계를 나타내는 것을 확인하였다. 최종 선정한 standard curve의 직선성 값은 R2=0.9865로, 이는 형광 신호 값을 통해 MMP-9 농도의 변화를 98.65% 설명할 수 있음을 의미한다. 또한, 구축한 standard curve를 사용한 정량 분석 결과는 재현성과 일관성, 정확성에서 높은 수준의 신뢰성을 보였다. 이는 MMP-9 분석 시스템이 신뢰할 수 있는 결과를 제공할 수 있음을 의미하며, MMP-9의 정량적 분석이 신뢰성 높은 데이터를 제공할 수 있음을 시사한다.
Fig. 3. Standard curve for quantitative analysis. It was confirmed that the signal increases according to metalloproteinase-9 (MMP-9) concentration as a linear pattern for quantitative analysis (R2 value is 0.9865).
MMP-9 분석 시스템을 통해 분석 가능한 농도 범위와 분석적 성능을 확인하기 위해 성능 시험 평가를 수행하였다. 앞서 구축한 standard curve를 사용하여 MMP-9 분석 시스템의 민감도를 확인하기 위해 분석 가능한 최소 농도(LOD)와 정량 분석이 가능한 최소 농도(LOQ)를 확인한 결과, LOD는 0.17 ng/mL이며, LOQ는 0.5 ng/mL로 확인되었다(Table 1). 이는 분석 시스템이 낮은 농도의 MMP-9을 정확하게 분석하고 정량화 할 수 있음을 의미한다.
LOD/LOQ
| LOD | 0.17 |
| LOQ | 0.5 |
LOD: 3.3 × (standard deviation of blank)/slope.
LOQ: 10 × (standard deviation of blank)/slope.
LOD, limit of detection; LOQ, limit of quantitation.
또한, 실험의 일관성과 재현성 확인을 위해 반복도, intra-assay, inter-assay를 진행하였다. 반복도 실험에서 MMP-9 표준물질 5, 50, 100 ng/mL를 5회 반복 측정한 결과, CV는 10% 미만으로 나타났으며(Table 2), 이는 측정값의 일관성이 높음을 의미한다. Intra-assay와 inter-assay 실험에서도 각각 하루와 이틀 동안 동일한 실험 조건에서 반복 측정한 결과, CV가 10% 미만으로 유지되는 것을 확인하였다(Table 3).
Repeatability
| MMP-9 concentration (ng/mL) | No. of samples | CV (%) |
|---|---|---|
| 5 | 5 | 7.03 |
| 50 | 5 | 5.14 |
| 100 | 5 | 4.36 |
MMP-9, metalloproteinase-9; CV, coefficient of variation.
Reproducibility
| 5 ng/mL (n=3) | 50 ng/mL (n=3) | 100 ng/mL (n=3) | ||
|---|---|---|---|---|
| Intra-assay | CV (%) | 7.03 | 5.14 | 4.36 |
| Inter-assay | CV (%) | 2.1 | 4.5 | 2.1 |
CV, coefficient of variation.
이어서, MMP-9 분석 시스템의 신뢰성을 평가하기 위해 안구건조증 환자들이 흔히 사용하는 인공눈물이 분석 시스템에 비특이적인 영향을 미치는지 확인하기 위해 간섭 테스트를 수행하였다. 여러 종류의 인공눈물을 동일한 조건에서 측정한 결과, 모든 인공눈물에서 MMP-9 측정값에 유의미한 변화가 나타나지 않음을 확인하였다(Fig. 4). 이는 인공눈물이 분석 시스템의 민감도와 정확도에 간섭을 나타내지 않음을 의미하며, MMP-9 분석 시스템이 실제 임상 환경에서도 안정적인 진단 도구로 활용될 수 있음을 보여준다.
Fig. 4. Interference reaction. ⓐ Eye Tok Eye Drops (Kwang-dong Pharm.). ⓑ Tinkle Eye Drops (Unimed Pharm Inc.). ⓒ Nazorin Eye Drops (Han Lim Pharm.). ⓓ EyetearPlus Eye Drops (Sinil Pharm.). ⓔ Prenz Eye Drop’S Sol. (JW Pharm.). The artificial tears commonly used by patients with dry eye syndrome did not show any non-specific reactions in the testing system.
본 연구를 통해 MMP-9을 활용한 염증성 안구건조증 진단 및 정량분석이 가능한 진단 검사 시스템을 개발하였다. 개발된 형광 면역 분석 기반 정량 진단 검사 시스템은 염증성 안구건조증 바이오마커인 MMP-9을 효과적으로 검출하며, 이를 통해 염증성 안구건조증을 특이적으로 진단할 수 있다. 이 시스템은 눈물 내 MMP-9 농도의 정량 분석을 통해 염증의 중증도를 구분할 수 있으며, 이로 인해 초기 단계의 안구건조증을 조기에 발견하고, 염증 정도에 따라 적절한 치료를 제공하는 데 기여할 것으로 기대된다. 향후 연구에서는 본 시스템이 다양한 임상 샘플에서의 유효성을 평가하기 위해 중증도 단계별로 충분한 눈물 샘플을 확보하여, 보다 정밀한 분석을 진행할 필요가 있다. 또한 다양한 임상 조건에서의 성능을 평가하기 위해 병원 및 자가 진단이 가능한 환경에서의 현장 실험을 진행하여 본 시스템이 실제 임상 환경에서의 진단 도구로서의 유용성을 확립할 예정이다. 이러한 연구를 통해 본 시스템이 실제 임상 환경에서 진단 도구로서의 신뢰성을 높이고, 염증성 안구건조증의 진단 및 효과적인 관리에 기여할 수 있도록 할 것이다.
None.
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
This work was supported by the Technology Innovation Program (20022852, Development of 0.2 micron cellulose acetate membrane for biopharmaceutical industry) funded By the Ministry of Trade, Industry & Energy (MOTIE, Korea).
Conceptualization: IHC. Data curation: JS. Formal analysis: all authors. Funding acquisition: IHC. Investigation: all authors. Methodology: all authors. Project administration: all authors. Resources: all authors. Software: all authors. Supervision: IHC. Validation: all authors. Visualization: all authors. Writing – original draft: JS. Writing – review and editing: all authors.
